荧光定量PCR(SYBR Green)详细操作步骤
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在定量PCR（rt-PCR或qPCR）中，荧光信号由荧光探针或荧光DNA结合染料（如SYBR Green）产生，其强度与PCR产物分子（扩增子）的数量成正比。每次循环后收集荧光信号强度，通过绘制荧光强度与循环数的图，qPCR仪器生成扩增曲线，表示PCR过程中的产物累积。样品中特定序列（DNA或RNA）丰富时，扩增在较早循环中观察到，Ct值小；稀少时，稍后循环观察到扩增，Ct值大。
此指南涵盖了总RNA提取、两步法逆转录定量PCR（qRT PCR）操作和数据分析。
所有步骤均需在超净工作台上进行，紫外照射至少15分钟。所有试剂仅用于此实验。使用75％乙醇或其他去污剂擦拭工作台，避免表面污染。进入荧光定量PCR实验室后，需佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套，避免与同事交谈，防止PCR模板污染。实验中使用各种离心管、头及配制试剂和溶解沉淀用的水，均应使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，以去除吸附的RNA酶污染。使用Trizol试剂时，避免接触皮肤或衣服，避免吸入蒸气。qPCR反应需要qPCR级水、试剂和试管。务必使用正确类型的qPCR光学PCR管和盖子，不可用普通PCR管。加样前规划加样顺序，避免交叉污染。所有实验应设置无模板对照，包含除DNA或cDNA样品外的所有反应组分。先配制qPCR反应混合液，减少误差。加样后上机前，通过瞬离将反应液至管底并消除气泡，避免气泡干扰荧光检测和降低酶活性，影响扩增效率。
试剂准备完毕，接下来进行操作流程：总RNA提取、反转录、设计引物、q-PCR。
总RNA提取包括：A.组织样本快速研磨，加入Trizol裂解液；B.全血样品加入红细胞裂解液，室温孵育后离心；C.细胞样品，细胞悬浮液加入Trizol，直接裂解或保存。直接法步骤包括：加入Trizol，冰上孵育；离心转移上清；加入氯仿，剧烈振荡；离心分层；加入异丙醇；离心分离RNA沉淀；干燥并溶解RNA。离心柱法按照提取试剂盒说明书进行。
反转录步骤包括：检测RNA纯度和完整性，紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度，通过TE缓冲液稀释并测量260nm和280nm吸光度。根据比率判断RNA纯度，RNA产量变化可能因材料类型、数量和储存条件而异。琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性，28S/18S比值大于2表示RNA完整度高。
引物设计需在Primer5.0软件上完成，遵循标准：PCR扩增子长度50-180bp；引物长度17-25bp；GC含量45-55%；Tm58-68℃，引物对间差异不超过2℃；碱基分布随机均匀；3′端避免AT、GC密集区域；引物自身和引物间不互补；3′末端为G或C；避免DNA污染，避免跨外显子接头区；设计2-3对引物，预实验筛选最佳引物；NCBI数据库比对确保特异性。
q-PCR反应使用cDNA模板10倍稀释液加入反应体系，避免过高浓度的反转录体系残留抑制DNA聚合酶活性。扩增循环包括熔解程序：变性、退火、延伸。变性加热dsDNA成单链，退火使互补序列结合，延伸DNA聚合酶高效延伸。熔解曲线描绘dsDNA解链成ssDNA时的荧光变化，判断qPCR反应的特异性。内参用于优先计算靶基因的相对表达量，消除总RNA量差异引起的表达假性差异。
相对定量比较同一基因在样本间的表达差异，无需精确拷贝数，关注与未处理样品组的表达变化。ΔΔCt方法通过比较目的基因Ct值与内参Ct值计算ΔCt，得到实验组与对照组的ΔΔCt，表示目的基因表达水平的倍数差异。
操作中遇到的难题包括：RNA收获率低、RNA降解、Abs260/Abs280比率低、DNA污染、下游反应中RNA表现不佳、熔解曲线有杂峰等，应采取相应措施解决。在实验过程中，遵循上述指南，可以有效避免常见问题，确保实验结果的准确性和可靠性。
