质粒构建那些事儿
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发布时间：2024-10-10 19:06
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热心网友
时间：2024-10-10 19:16
质粒构建是分子生物学中关键操作，用于组装与修改DNA，支持基因表达、编辑及其他生物技术应用。具体步骤如下：
首先，设计质粒。需挑选载体，如真核表达、报告或克隆载体。此外，需确定基因序列，选择适当性酶切位点或应用无缝克隆技术。接下来，通过PCR扩增目标基因或合成所需DNA片段。之后，使用软件绘制质粒图谱，确保所有元件正确组装。
接着，制备质粒与插入片段。进行DNA提纯，电泳分离并提纯目标片段。使用性内切酶切割载体与插入片段，确保正确方向与位置。
进入连接反应阶段。将切割的载体与插入片段混合，添加连接酶，进行连接。之后，将连接质粒转化至宿主细胞，通常使用大肠杆菌作为宿主。
筛选克隆。平板培养转化细胞，挑选含适当选择标记的菌落。进行菌落PCR验证插入序列，随后提纯PCR验证正确的菌落，进行扩大培养。
进行质粒提取与验证。使用质粒小提或大提试剂盒提取质粒DNA，通过DNA测序验证插入片段序列。最后，根据需求进行功能验证，如蛋白表达或报告基因活性检测。
舒桐科技提供多种质粒骨架，并根据客户需求添加标签、改变荧光标签或筛选标记。展示基因表达或干扰效果案例：一是将IGF2BP3基因构建在慢病毒过表达质粒上，通过病毒包装与细胞感染，荧光占比约90%，qPCR检测过表达约11倍。二是将DHODH基因构建在慢病毒敲减质粒上，进行病毒包装与细胞感染，基因敲减效率达90%。
热心网友
时间：2024-10-10 19:08
质粒构建是分子生物学中关键操作，用于组装与修改DNA，支持基因表达、编辑及其他生物技术应用。具体步骤如下：
首先，设计质粒。需挑选载体，如真核表达、报告或克隆载体。此外，需确定基因序列，选择适当性酶切位点或应用无缝克隆技术。接下来，通过PCR扩增目标基因或合成所需DNA片段。之后，使用软件绘制质粒图谱，确保所有元件正确组装。
接着，制备质粒与插入片段。进行DNA提纯，电泳分离并提纯目标片段。使用性内切酶切割载体与插入片段，确保正确方向与位置。
进入连接反应阶段。将切割的载体与插入片段混合，添加连接酶，进行连接。之后，将连接质粒转化至宿主细胞，通常使用大肠杆菌作为宿主。
筛选克隆。平板培养转化细胞，挑选含适当选择标记的菌落。进行菌落PCR验证插入序列，随后提纯PCR验证正确的菌落，进行扩大培养。
进行质粒提取与验证。使用质粒小提或大提试剂盒提取质粒DNA，通过DNA测序验证插入片段序列。最后，根据需求进行功能验证，如蛋白表达或报告基因活性检测。
舒桐科技提供多种质粒骨架，并根据客户需求添加标签、改变荧光标签或筛选标记。展示基因表达或干扰效果案例：一是将IGF2BP3基因构建在慢病毒过表达质粒上，通过病毒包装与细胞感染，荧光占比约90%，qPCR检测过表达约11倍。二是将DHODH基因构建在慢病毒敲减质粒上，进行病毒包装与细胞感染，基因敲减效率达90%。
