实验操作 I 如何自己构建质粒,步骤及原理详解
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质粒，作为20世纪50年代初在大肠杆菌中的发现，是于染色体的闭合环状DNA，如今在基因工程中扮演着重要角色。它具备自主复制、可扩增、可转移及不相容性等特点，广泛应用于生物医药产品，如药物和疫苗开发。
质粒载体如pBR322，是最常用的一种，它有4361bp长，带复制起始位点和抗生素标记，能方便地克隆基因。pBR322的名称中，“p”代表质粒，BR来自两位研究者的名字，322是实验编号。其特点是：小分子量，专一复制，抗生素标记，高拷贝数。
构建质粒的原理是通过克隆技术，如酶切连接、Gateway、Golden Gate和Gibson等，将基因插入载体。首先，PCR扩增外源DNA，然后用酶切割载体和DNA片段，通过DNA连接酶将它们缝合。选择合适的克隆方法至关重要，如酶切连接法需要设计引物引入酶切位点，然后连接到宿主细菌，通过筛选获得重组克隆。
实验室中常见的构建方法有：传统酶切连接（依赖碱基互补配对），如T4连接酶用于连接平端或粘性末端；高通量的Gateway技术，适用于大片段基因克隆；LIC和SLIC技术则无需碱基互补，更高效；Gibson组装则通过一个体系完成酶切和连接，提高效率。
质粒构建流程包括：提取质粒，扩增目的基因，酶切处理，连接，转化宿主细胞，培养筛选。整个过程要求精确的酶切和连接，以及定向克隆策略，以确保目的基因在宿主细胞中的正确表达。
最后，质粒载体的制备需要考虑双酶切以避免自连，而目的基因片段的制备则依赖PCR扩增和引物设计。酶切连接时，需确保酶切产物的兼容性和连接效率，通过转化鉴定确保构建的成功。
