优质绵羊冷冻胚胎引进及胚胎移植试验

ｘＵＭＵＳＨＯＵＹＩ畜牧兽医　优质绵羊　冻胚胎引进及胚胎移植试‘验冰　张新军　，刘长彬　。倪建宏　，万鹏程　（１．新疆生产建设兵团第七师一二七团畜牧服务中心，新疆　奎屯８３３２００；　２．新疆农垦科学院畜牧兽医研究所／省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室）　摘要：２Ｏ１４—２０１５年先后从澳大利亚西奥谷河育种公司　引进萨福克和肉用美利奴肉羊冷冻胚胎７７３枚。解冻后可用　于移植的胚胎为７３９枚，移植受体羊７３９只。其中，Ａ级胚胎　５５３枚，Ｂ级胚胎１８６枚，且Ａ级胚胎移植受胎率为５０．２７％　（２７８／５５３），明显高于Ｂ级胚胎的３９．２５％（７３／１８６），差异显　著。同时，对比了大尾羊和细毛羊２种受体羊品种间的受胎　率，结果为差异不显著。不同饲养条件下胚胎移植受胎率结　果显示，全舍饲羊受胎率为３９．５６％（１７８／４５０），放牧羊受胎率　为４９－４８％（１４３／２８９），两者差异显著。大规模进口肉羊冷冻胚　胎进行移植在基层生产单位的成功应用，为肉羊产业发展提　供了优良的种质资源。　关键词：绵羊；冷冻胚胎；胚胎移植　动物胚胎工程技术是家畜繁殖学领域的一项　高新技术，既将良种母畜受孕后的早期胚胎通过人　工方法取出，再将其移植到同种、同生理时期的母　畜体内，并继续发育成新个体。胚胎移植亦称为受　精卵移植，或称为“借腹怀胎”［１－－２１。哺乳动物胚胎移　植技术的发展已有１００多年的历史。１８９０年，英国　剑桥大学的Ｗａｌｔｅｒ　Ｈｅａｐｅ在安哥拉兔上首次成功获　得胚胎移植后代。美国的Ｗａｒｗｉｃｋ等在１９３４年成　功进行了绵羊胚胎移植，该技术已发展了７８年［３１。　以引进动物冷冻胚胎的形式进行胚胎移植，不但节　省人力、物力、财力，还可一次大量引进，而且可以　把引种过程中疾病传播的几率降到最低限度　。马　保华研究报道，供体与受体之间同期发情同步差在　±１　ｄ或０～２４　ｈ，胚胎移植受胎率较高，能够获得较　为理想的胚胎移植效果［５－　Ｏｌ。　收稿日期：２０ｌ６—０９—２３　基金项目：国家级肉羊“胚胎移植基地”和兵团级肉羊“胚胎　生产”基地；兵团院士基金专项（２０１３ＢＢ０２３）；兵团重大科技　项目（２０１３ＡＡ００３—２）。　通讯作者：刘长彬（１９７７一），男，河南虞城人，副研究员，研究　方向为动物遗传育种与繁殖。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｌｃｈａｎｇｂｉｎ＠１６３．ｃｏｍ。　目前，中国许多省市、自治区等都已尝试进行大　规模羊胚胎移植工程，并取得了一定的成绩。据统　计，羊鲜胚胎移植妊娠率达５４．４％～６０．０％，最高达　７０．８％ｔ“１。现将在２０１４—２０１５年进行的绵羊规模化　冷冻胚胎移植试验进行总结。　１材料与方法　１．１试验材料　１．１．１胚胎品种及来源　品种为萨福克和肉用美利奴羊，购自澳大利亚　西奥谷河育种公司。　１．１．２供试动物　受体羊为２～５岁生殖系统健康、无传染病的本　地大尾羊和新疆细毛羊。　１．１．３供试器材　拥有自主知识产权的羊专用手术架，腹腔内窥　镜（ＯＬＹＭＰＵＳ），实体显微镜（ＮＩＫＯＮ），Ｈｏｌｄｉｎｇ液、　蔗糖液、冷冻液（ＩＣＰ），ＣＯ　钢瓶（国产），恒温水浴　锅，止血钳、手术刀、剪刀、持针钳、缝合针及线、创　巾、工作服、注射器（１　ｍＬ、５　ｍＬ和２０　ｍＥ）、先穴式胚　胎移植管、一次性培养皿、温度计、布胶带、曲别针、　碘酒及酒精、消毒液、抽纸等主要实验器材及耗材。　１．１．４供试药品　同期发情阴道海绵栓、孕马血清促性腺激素　（ＰＭＳＧ，１　０００　ＩＵ・瓶）、黄体酮、油剂青霉素、速眠新　及苏醒灵（长春农牧大学军事兽医研究所）。　１．２　方法　１．２．１胚胎鉴定　在体视镜下对解冻的胚胎进行分级鉴定，根据　胚胎形态的完整性及内细胞团的致密程度分为Ａ、　Ｂ、Ｃ级。胚胎鉴定标准：（１）胚胎细胞团呈均匀对称　的球形，形态典型，单个分裂球的大小、颜色、密度一　致，轮廓清晰，胚胎发育阶段与预期的发育阶段一致　者为Ａ级；（２）胚胎细胞团的大小和形状以及单个　细胞的颜色和密度存在一定的不规则，细胞质较致　２０１６・１１扬翟秽量吖强昌　３５　畜牧兽医　［，ＪＭＵＳＨＯＵ　重　密，分布均匀，具有完好的、具活性的胚胎细胞团者　为Ｂ级；（３）胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞　植后，Ａ级胚胎受胎率为５０．２７％（２７８／５５３），Ｂ级胚　胎为３９．２５％（７３／１８６），两者之间差异显著（Ｐ＜　０．０５），见表１。　表１冷冻胚胎解冻后胚胎级别分布及移植受胎率情况　有明显变异，分裂球轮廓稍不清晰，或部分不清晰，　细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，但仍有部分　细胞结构是完好的、有活性的胚胎细胞团者为Ｃ级。　１．２．２胚胎移植　采用微创手术，用移胚针将符合质量要求的胚　胎移植到与胚胎胚龄同期化的受体羊子宫角内，移　植后立即颈部肌肉深部注射黄体酮１　ｍＬ。　１．２Ｉ３妊娠检查　于胚胎移植后４５～６０　ｄ进行Ｂ超检查，统计受　胎率。　２．２不同品种受体羊的受胎率分析　本试验共处理了２７４只羊，大尾羊发情率为　９１．３６％（１４８／１６２），细毛羊发情率９６．４３％（１０８／１１２）；　１．２．４试验资料的统计与分析　试验数据采用卡方检验进行差异显著性分析。　２结果　大尾羊移植受胎率３６．４９％（５４／１４８），细毛羊移植受　胎率４２．５９％（４６／１０８）。从表２可以看出，在相同的　同期发情处理方式下，在同期发情效率上差异不显　２．１　不同胚胎级别对受体受胎率的影响　’　在本试验中，共解冻了引进冷冻胚胎７７３枚，达　到移植级别的胚胎７３９枚，Ｃ和Ｄ级胚胎３４枚，占　可移植胚胎的４．６％（３４／７３９）；将可移植胚胎用于移　著（Ｐ＞０．０５），２个品种间的受胎率同样差异不显著　（Ｐ＞０．０５），见表２。　２．３不同饲养方式对受体受胎率的影响　表２不同绵羊品种对受胎率的影响　注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），相同小写字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）。下同。　本试验共移植了受体７３９只，其中全舍饲羊　冻胚胎解冻后，内细胞团散、透明带破裂和解冻后找　４５０只，放牧羊２８９只。全舍饲羊受胎率为３９．５６％　（１７８／４５０），放牧羊受胎率为４９．４８％（１４３／２８９），放牧　饲养管理条件下的受体羊获得更高的受胎率，差异　显著（Ｐ＜０．０５），见表３。　表３　不同饲喂方式对绵羊受体受胎率的影响　不到明显的胚胎等情形，而无法进行胚胎移植，因　此，Ｃ和Ｄ级胚胎不用于冷冻，如果有条件可以直　接鲜胚移植。　受体羊同期发情效率的高低是影响胚胎移植效　率的关键因素之一，一般情况下，同期发情效率受季　节、营养、处理方案、药物等的影响。本试验中对２种　受体羊品种进行了同期发情处理，采取每天观察２　次，每次观察发情时间３０　ｍｉｎ至ｌ　ｈ，且看到受体羊　表现为爬跨静立、外阴出现红肿、流透明粘液和精神　不安等即判断为发情ｎ２１。从表２可以看出，大尾羊与　小尾羊的发情效率相当，差异不显著。经过胚胎移植　后，两组的受胎率差异同样不显著。　３结论　胚胎的冷冻对胚胎是一种伤害，因此，在冷冻前　必须选择Ａ级胚胎进行冷冻，以确保解冻后的胚胎能　够维持Ａ级或Ｂ级的分级级别，才能有效保障受体羊　获得更高的移植受胎率。从表１可以看出，Ａ级胚胎　经冷冻解冻后获得了５Ｏ．２７％（２７８／５５３）的受胎率，而　Ｂ级胚胎冷冻解冻后获得了３９．２５％（７３／１８６），两者　之间差异显著（Ｐ＜０．０５）。冷冻试验的Ｃ和Ｄ级冷　３６　警　翟穆至吖段２１３１６・１１　从表３可以看出，放牧绵羊的受胎率高于全舍　饲，主要是因为放牧羊能够充分运动，再者是放牧羊　能够采食到优质的新鲜牧草、牧草果实或优质干草。　由于放牧羊能够获得更为全面的维生素、微量元素　和蛋白的营养供应，因此，放牧羊的移植受胎率明显　ＸＵＭＵＳＨＯＵＹ１畜牧兽医　绵羊母羔多胎基因（ＦｅｃＢ）检测技术应用要点术　张云生　。姚晓鹏　。周　平　，王新华　，刘守仁　（１．新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆　石河子８３２０００；２．新疆惠达农牧业科技有限公司）　摘要：小片断法高分辨率熔解曲线（ＳＡ—ＨＲＭ）技术检　测绵羊多胎ＦｅｃＢ基因具有准确、高效、自动化程度高等特　点，可以在短时间内实现大规模群体多胎基因检测的目的。　近两年已推广应用于兵团和自治区的多家肉羊养殖场及育　种场的８　ｏ００多只绵羊，明显提高了多胎绵羊及其杂交后代　的产羔率，产生了显著的经济效益，是目前多胎绵羊养殖过　程中不可缺少的关键性技术。为尽快利用本项技术为新疆及　绵羊属单胎ａｔｆ￣Ｌ类动物，但有些绵羊品种却具　有能够稳定遗传的多胎性状，ＦｅｃＢ基因是目前已知　的绵羊高繁殖力主效基因。我国的小尾寒羊和湖羊　的产羔率分别为２７０％、２５０％，其携带的多胎ＦｅｃＢ　基因是决定个体多胎性状的主要因素。在小尾寒羊、　湖羊的杂交后代群体中，均能检测到携带多胎ＦｅｃＢ　基因的个体，多胎ＦｅｃＢ基因纯合型（ＢＢ）母羊个体　产羔率约为２５０％，杂合型（Ｂ＋）母羊个体产羔率约　为２００％，因此，通过多胎基因检测鉴定，可有效区　兵团肉羊产业发挥提质增效作用，本文就ＳＡ—ＨＲＭ基因分　型技术在肉羊养殖实际生产中的推广应用经验及要点进行　了概述。　关键词：绵羊；母羔多胎鉴定；ＦｅｃＢ；ＳＡ—ＨＲＭ　分纯合型（ＢＢ）、杂合型（Ｂ＋）以及野生型（＋十）的母羊　个体【１］，以检测结果为依据对生产母羊群体实行多胎　性能整群，将有效、精准的增加群体的繁殖力，可快　收稿日期：２０１６一Ｏ９—２７　基金项目：兵团重大科技项目“良种肉羊繁育与杂交配套　技术体系集成与示范”（２０１３ＡＡ００３—００１）；兵团国际科技　速提高兵团肉羊业的生产水平和科技含量。　利用小片断法高分辨率熔解曲线（ＳＡ—ＨＲＭ）　合作计划项目“基于血浆ＤＮＡ开发牛、羊妊娠诊断及ＦｅｃＢ　基因高效分型技术研究”（２０１４ＢＣ００３）。　通讯作者：张云生（１９７６一），男，副研究员，博士，研究方向　为绵羊育种。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｍｓｚｙｓ＠１６３．ｃｏｒｎ。　技术我们成功建立了简单、快速、准确的绵羊多胎　ＦｅｃＢ基因鉴定技术体系。在肉羊养殖实际生产中，　很短时间内就可实现大规模绵羊群体多胎性检测。　采用本项技术能够实现绵羊母羔早期多胎性状鉴　［５】马保华，张红，李键，等．山羊胚胎移植受体同期发情优化程　序研究［Ｊ］．西南农业学报，２００４，１７（５）：６６４—６６７．　［６］ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　Ｄ　Ｔ，Ｐｆｉｔｚｎｅｒ　Ａ　Ｐ，Ｗａｍｅｓ　Ｇ　Ｍ，ｅｔ　ａＬ　Ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　Ａｎｇｏｒａ　Ｇｏａｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｆｅｒｔ，　１９８３，６７（２）：４０３—４１０．　高于全舍饲羊的受胎率，差异显著（Ｐ＜０．０５）。　综上所述，绵羊胚胎移植是一个系统工程，其受　体选择、激素、时间、季节和管理与营养等一系列环　节紧密相扣，任何一个环节出现问题都将导致胚胎　移植失败。只有做到精心挑选受体、严格操作、无菌　措施以及精准移植等，胚胎移植工作才能收到满意　效果。　［７】李键，马保华，张红，等．胚胎移植不同品种受体羊同期发情　研究［Ｊ］．西南农业学报，２００５，１８（３）：３４３－３４７．　［８】马保华，王光亚，赵晓娥．胚胎移植供受体山羊发情控制及　配比问题的研究［Ｊ］．动物医学进展，１９９９，２０（３）：３５－３８．　参考文献　【１］傅文栋，李风德，牛建克．绵羊胚胎移植研究进展［ｊ】：黑龙江　动物繁殖，２０１０，（１８）５：２０—２１．　【９］刘长彬，杨永林，张宾，等．阿勒泰大尾羊受体羊同期发情处　理程序优化效果［Ｊ】．甘肃畜牧兽医，２０１３，４３（１）：３６—３７．　ｆｔ０］陈卓，谷红伟，方治中，等．肉羊二细胞期胚胎（二分胚）移　植试验研究［Ｊ］．甘肃畜牧兽医，２０１６，４６（１１）：８３—８５．　［１１］王玉琴，赵有璋．绵羊胚胎移植关键技术［Ｊ］．中国草食动　物，２ＯＯ４（Ｓ１）：８２—８４．　［２】侯引绪．绵羊胚胎移植产业化技术研究［Ｄ】．北京：中国农业　大学，２００６．　【３】肖西山，程鹏，李玉冰，等．胚胎移植在家畜生产中的应用　ｆＪ］．北京农业职业学院学报，２００４，６０（１８）：２６－２８．　［４］李铭，黄恒，张立，等．绵羊规模化胚胎移植试验效果与分析　［Ｊ］．中国农学通报，２０１０，２６（１７）：１７一ｌ９．　［１２１重红，舒展，陈静波，等．影响农牧区绵羊胚胎移植效果因　素分析【Ｊ】．草食家畜，２０１１，６（２）：２７—３Ｏ．　ｉ￣１３１６・１　１扬翟茌至叫煞譬　３７