第２５卷２００６年第３期 ８月 大 豆 科学 Ｖｏｌ＿２５ Ｎｏ．３ ＡＵｆｆ． ２００６ ＳＯＹＢＥＡＮ ＳＣＩＥＮＣＥ ＳＯＥ法对大豆苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）基因 拼接的应用研究 宋柬 马会勤。 陈尚武 （１．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京１０００８３；２．中国农业大学果树学系，北京１０００９４） 摘要 利用ＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法对大豆苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）的两个外显子 进行拼接，得至ｌＪＬ完整的ＰＡＬ基因，表明这种方法是有效可行的。这种技术是作为对ｃＤＮＡ克隆的 初步改进与尝试，节约了成本，有一定的应用价值。 关键词 ＳＯＥ法；ｃＤＮＡ克隆；苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ） 中图分类号Ｓ ５６５．１ 文献标识码Ａ 文章编号 １Ｏ０Ｏ一９８４１（２００６）０３一Ｏ２２８一Ｏ６ 大豆（Ｇｔｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）栽培品种东北 春大豆系列（北丰１２）幼嫩叶片。 １．１．２质粒和菌种 １９８９年，Ｈｏｒｔｏｎ等人提出了ＳＯＥ法（Ｇｅｎｅ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，Ｇｅｎｅ ＳＯＥｉｎｇ），即 通过复制时ＤＮＡ链的交错延伸实现基因拼接［１］。 该方法是利用ＰＣＲ技术在体外进行有效的基因重 组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，该技术使 用简易。由于引物只需要与模板有效结合，尤其是 ５ 端序列不必与模板完全配对，因此扩增引物的５ 质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｅａｓｙ Ｔ载体试剂盒购自 Ｐｒｏｍｅｇａ公司；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ 为本实验室保存。 １．１．３工具酶及其它试剂 限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、 端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆［２ ］。 ＳＯＥ法正是利用这一特点，使两个基因出现一个重 叠区域，进而利用这段重叠区制造“长引物”（ｍｅｇａ ｐｒｉｍｅｒｓ），使基因拼接或重组得以实现【４ ］，ＳＯＥ原 理示意图如图１所示。利用这一方法，把大豆中的 苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）基因的两个外显子拼接在一 起，与从ｍＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ的技术路线相比， ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ等购自ＴａＫａＲａ公司；琼脂糖 凝胶ＤＮＡ回收试剂盒（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）为ＱＩＡＧＥＮ公司产品，质粒ＤＮＡ小量提取试 剂盒购自泽星科技公司（北京）；Ｔｒｙｐｔｏｎｅ和Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ为ＯＸＯＩＤ产品；琼脂糖为西班牙产品；Ｘ— 简化了克隆方法，节约了成本，降低了ＲＮＡ污染降 解的风险。 Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、氨苄青霉素等药品均为进口或国产生物 试剂。 １．２ 方法 １材料与方法 １．１ 材料 １．２．１大豆ＤＮＡ提取纯化 利用ＣＴＡＢ法进行ＤＮＡ的提取纯化，稍有改 进。原理方法参见文献［６］。 １．２．２引物设计与合成 １．１．１植物材料 ・收稿日期：２００６—０３—２３ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｉｅｅｍ ｎｕｍｂｅｒ．３０３７１００５＆３９９７０４６９） 作者简介：￣（１９８０－），女，中国农业大学食品科学与营养工程学院，硕士研究生，主要从事食品分子生物学研究，电话：０１０— ６２７３３９８６ Ｅ－－ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｉｒｌｉｋｅ＠１６３．ｃｏｒｎ 通讯作者：陈尚武，ｓｗｃｈｅｎ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com
３期 宋柬等：ＳＯＥ法对大豆苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）基因拼接的应用研究 ２２９ 外显子１引物序列： Ｆ１：５’一ＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧ Ｂ１：５’一ＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＴ ＮｄｅＩ 外显子２引物序列： Ｆ２：５’一ＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＣＴＧＧ Ｂ２：５’一ＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＣＡＴＡＧＧＴＡＣ ＸｈｏＩ 重组ＰＣＲ引物序列： Ｆ３：５’一ＧＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧ ＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧ一３’ ６０ｂｐ Ｂ３：５’－－ＣＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣ ＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＧ－－３’ ６０ｂｐ 其中引物Ｆ３和Ｂ３划线部分互补，为上海生工 聚合酶进行扩增。９４℃，５ｍｉｎ；５２℃，２ｍｉｎ；７２℃， 合成；常规引物Ｆ１和Ｂ１，Ｆ２和Ｂ２为赛百盛合成。 ２ｍｉｎ；９４℃，ｌｍｉｎ；５２℃，４５ｓ；７２℃，２ｍｉｎ；７２℃， １．２．３ ＰＣＲ扩增 ８ｍｉｎ；４℃，ｐａｕｓｅ ３５个循环。 ＧＭＰＡＬ外显子１、２的扩增采用２５ ｌ的标准 ＧＭ ＰＡＬ ｅｘｏｎ的扩增：以回收的Ｆ１Ｂ３和 体系（表１）。 Ｆ３Ｂ２两个片断互为模板和引物，用Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 表１ ＰＣＲ反应体系 聚合酶进行扩增。９４℃，５ｍｉｎ；９４℃，３０ｓ；３５℃， Ｔａｂｌｅ １ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ２ｍｉｎ；７２℃，２ｍｉｎ；７２℃，８ｍｉｎ；４℃，ｐａｕｓｅ ２Ｏ个循环 ＰｃＲ反应体系 用量 终浓度 后，再添加Ｆ１和Ｂ２引物，进行９４℃，５ｍｉｎ；５２℃， ＰＣＲ ｒｅｃｆｌｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ２ｍｉｎ；７２℃，２ｍｉｎ；９４℃，ｌｍｉｎ；５２℃，４５ｓ；７２℃， ｄｄＨ２Ｏ １４．７５ｔＪｌ ｌｍｉｎ；７２℃，８ｍｉｎ￣４℃，ｐａｕｓｅ ３５个循环。 ｌ０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ） ２．５ｔＪｌ １× ｄＮＴＰ（２．５ ｍＭ ｅａｃｈ）Ｍｉｘｔｕｒｅ ２．０ｔａｌ ２００ｔａＭ Ｐｒｉｍｅｒ １（２．５ｐｍｏｌ／Ｍ） ２．５ｔＪｌ ０．２５ｐｍｏｌ／ｔａｌ Ｐｒｉｍｅｒ ２（２．５ｐｍｏｌ／ｔＪ１） ２．５ｔＪｌ ０．２５ｐｍｏｌ／ｔａｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ０．５ｔＪｌ含１０ｎｇＤＮＡ ＿ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／ｌａ１） ０．２５ｔａｌ ０．０５Ｕ Ｂ２ 反应条件如下： ＧＭ ＰＡＬ１的扩增：以大豆ＤＮＡ为模板，Ｆ１ Ｂ１ 亡＝二＝ 为引物，Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶进行扩增。９４℃， Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ５ｍｉｎ；５２℃，２ｍｉｎ；７２℃，２ｍｉｎ￣９４℃，ｌｍｉｎ；５２℃， 重组ｐｃＲ／ｍ物 ４５ｓ；７２℃，ｌｍｉｎ；７２℃，８ｍｉｎ￣４＂Ｃ，ｐａｕｓｅ ３５个循环。 ＧＭ ＰＡＬ２的扩增：以大豆ＤＮＡ为模板，Ｆ２Ｂ２ 图１ ＳＯＥ法拼接基因图示 为引物，Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶进行扩增。 Ｆｉｇ．１ Ｍａｐｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ＳＯＥｉｎｇ ９４℃，５ｍｉｎ；５２℃，２ｍｉｎ；７２℃，２ｍｉｎ；９４℃， １．２．４ ＰＣＲ产物回收、克隆 ｌｍｉｍ５２℃，４５ｓ；７２℃，２ｍｉｎ；７２℃，８ｍｉｎ￣４℃，ｐａｕｓｅ ＰＣＲ产物用琼脂糖回收试剂盒按照说明书回 ３５个循环。 收片断，用Ｔ载体进行连接。电击转化ＤＨ５ｅ感受 Ｆ１Ｂ３的扩增：以质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｅａｓｙ ＧＭ 态细胞，在含有氨苄青霉素、ＩＰＴＧ和Ｘ—Ｇａｌ的ＬＢ ＰＡＬ１为模板，Ｆ１ Ｂ３为引物，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｔａｑ ＤＮＡ 平板上用蓝白斑筛选重组子。 聚合酶进行扩增９４℃，５ｍｉｎ；５２℃，２ｍｉｎ；７２℃， １．２．５克隆载体鉴定及序列分析 ２ｍｉａｒ ９４℃，ｌｍｉｎ；５２℃，４５ｓ；７２℃，ｌｍｉｎ；７２℃， 挑取阳性克隆的单菌落３７℃过夜培养，第二天 ８ｍｉｎ；４＂Ｃ，ｐａｕｓｅ ３５个循环。 提取质粒。重组质粒经ＰＣＲ和限制性内切酶酶切 Ｆ３Ｂ２的扩增：以质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｅａｓｙ ＧＭ 电泳鉴定，分析正确后，送上海生工进行测序。 ＰＡＬ２．为模板，Ｆ３ Ｂ２为引物，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｔａｑ ＤＮＡ 维普资讯 http://www.cqvip.com
大豆科学 ３期 ２结果与分析 ２．１外显子片断扩增结果 为模板，分别以Ｆ１ Ｂ１和Ｆ２ Ｂ２为引物扩增，获得 如图２和图３中的结果。两对引物分别扩增到 ４００ｂｐ和１９００ｂｐ的片断。回收连接到Ｔ载体中，分 别命名ＧＭ ＰＡＬ１和ＧＭ ＰＡＬ２，测序结果如后。 大豆中的苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）基因的两个外 显子分别为３９２ｂｐ和１７７０ｂｐ。以提取的大豆ＤＮＡ １ ２ ３ Ｍ ２０００ ２０００ ５００ 图２ ＧＭ ＰＡＬ１的扩增结果 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＭ ＰＡＬ１ １．２．３：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ 图３ ＧＭ ＰＡＬ２的扩增结果 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＭ ＰＡＬ２ １．２．３．４：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ５：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ ２．２重组ＰＣＲ的扩增结果 断，各自为模板引物进行重组ＰＣＲ，２０个循环后，加 入引物Ｆｌ和Ｂ２，补充ＰＣＲ反应体系，尤其是 ｄＮＴＰ和Ｅｘ Ｔａｑ酶，继续进行３５个循环的ＰＣＲ反 分别以测序正确的阳性克隆质粒ｐＧＥＭ－－Ｔ— Ｅａｓｙ ＧＭ ＰＡＬ１和ｐＧＥＭ－－Ｔ—Ｅａｓｙ ＧＭ ＰＡＬ２为 模板，再分别以Ｆ１ Ｂ３和Ｆ３ Ｂ２为引物扩增，得到如 图４中的结果。回收获得约４００ ｂｐ和１９００ｂｐ的片 ｌ ２ ３ Ｍ ５ ６ ７ 应，得到如图５中的结果。回收连接到Ｔ载体中，命 名为ＧＭ ＰＡＬ ｅｘｏｎ，测序结果如后。 Ｍ ｌ ２ ３ ２０００ １０００ ２０００－－－－—－一 １０００一 图４ Ｆ１Ｂ３和Ｆ３Ｂ２的扩增结果 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ１Ｂ３ Ｆ３Ｂ２ １．２。３：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＩＢ３ Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ ５．６．７：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ３Ｂ２ 图５重组ＰＣＲ ＧＭ ＰＡＬ ｅｘｏｎ的扩增结果 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＯＥ Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ １．２．３：ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＯＥ ２．３ ＰＣＲ扩增产物的测序分析结果 亚克隆ＧＭ ＰＡＬ ｅｘｏｎ酶切鉴定阳性质粒测序，序 将Ｆ１、Ｂ１和Ｆ２、Ｂ２两扩增产物经Ｔ一载体克 列分析拼接区域外显子结合正确（阴影部分为重叠 隆、酶切鉴定阳性亚克隆质粒进行ＤＮＡ测序，与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ序列比对分析证明所获得的ＧＭ ＰＡＬ １、 ２（相应于第一和第二个外显子）的序列同源率达到 ９９ （图６和图７）。将ＳＯＥ—ＰＣＲ重组扩增的产物 区域，如图８所示），其它序列与Ｇｅｎｂａｎｋ大豆 ＰＡＬ１序列同源率也达到９９ ，完全符合预期的设 计结果。这表明ＳＯＥ—ＰＣＲ法重组技术对本实验 的ＰＡＬ基因拼接是成功的。 维普资讯 http://www.cqvip.com
３期 宋柬等：ＳＯＥ法对大豆苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）基因拼接的应用研究 １ ＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＴ ６１ ＡＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣ，ＣＧＣ，ＣＣ，Ｃ，ＣＧＧＡＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧ １２１ ＧＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＴＣ（ ；ＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＣ １８１ ＡＣＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡ ２４１ ＧＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣ ３Ｏ１ ＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＡＣＣＡＡＡ ３６１ ＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＴＡＡ 图６ ＧＭ ＰＡＬ１的测序结果 Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＧＭ ＰＡＬ１ １ ＡＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＣ ６ １ ＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＴ １２ １ ＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴ １８１ ＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＧＧ ２４ １ ＴＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＡＣＧＣ ３Ｏ １ ＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡ ３６１ ＡＧＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＣＴＴ ４２ １ ＴＧＡＧＧＣＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴ ４８ １ ＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡ ５４１ ＡＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＴＡＴＣＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣ ６０１ ＴＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＣｒＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧ ６６１ ＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴ ７２ １ ＴＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＧＧ ７８ １ ＣＡＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＡＣＧＴＴ ８４ １ ＴＧＧＣＡＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＣＴ ９Ｏ １ ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＴＧ ９６ １ ＧＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＣＡＡ １０２ １ ＡＴＣＣＡＧＴＡＡＣＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＴＧＧ １０８１ ＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡ ｌ１４１ ＣＡＴＴＣＴＴＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡ １２０１ ＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＴＧＡ（ ＣＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧ １２６１ ＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＴ １ ３２ １ ＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡ １ ３８ １ ＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＧＴ １ ４４ １ ＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧ １５０１ ＴＴＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＧ １５６１ ＡＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＣＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＡ １ ６２ １ ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＣ １６８１ ＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣ １７４１ ＣＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡ １８０１ ＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＡＴＡＧＧＡＣＣ １ ８６ １ ＴＴＧＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡ 图７ ＧＭ ＰＡＬ２的测序结果 Ｆｉｇ．７ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＧＭ ＰＡＬ２ １ ＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＴ ６１ ＡＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧ １２１ ＧＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧ ＡＧＡＧＡＣＴＣＴＣ １８１ ＡＣＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡ ２４１ ＧＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＡＧＣ￣ＧＡＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣ ２３１ 维普资讯 http://www.cqvip.com
２３２ 大豆科学 ３期 ３０１ ＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＡＣＣＡＡＡ ３６１ ＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴ ４２ １ ＧＧＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧｃＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＡ ４８１ ＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣ ５４１ ＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴ ６Ｏ １ ＧＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡ ６６ １ ＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＡＣＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＣ ７２ １ ＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧｃＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴ ７８１ ＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＣＴ ８４１ ＧＡＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＴ ９Ｏ １ ＴＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＴ ９６１ ＡＴＣＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＣＴＴＧ １０２１ ＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＴ １０８１ ＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣ １１４１ ＡＡＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＧＣＡＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣ １２０１ ＣＣＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧ １２６１ ＴＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣ １３２１ ＡＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴ １３８１ ＴＣＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＡＡＣＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴ １４４１ ＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＴＴＧＧＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡ １５０１ ＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴ １５６１ ＧＡＣＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴ １６２１ ＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＧ １６８１ ＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣ １７４１ ＡＧＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＴＡ １８０ １ ＡＡＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧ １８６ １ ＧＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＧＡＧＴ １９２１ ＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＣＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＴＴ １９８１ ＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＧＴＧＡＡ ２０４１ ＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧ ２ １Ｏ １ ＴＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＡ ２１６１ ＣＡ 图８重组ＰＣＲ产物ＧＭ ＰＡＬ ｅｘｏｎ的测序结果 Ｆｉｇ．８ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［ｏｒ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＧＭ ＰＡＬ ｅｘｏｎ 到了控制，大大提高了ＰＣＲ的准确性。如果不采用 ３讨论 可信度高的Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶，用引物Ｆ１、Ｂ３ 和Ｆ３、Ｂ２分别进行ＰＣＲ扩增的两个片段的３ 端就 重组ＰＣＲ反应要分成两步：第一步只加两个长 会出现Ａ，在两个外显子重叠的区域就会多出碱基 ｎｇ Ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）移 引物，彼此作为引物和模板进行配对扩增，使产物得 Ａ，造成开放阅读框（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉ到富集；第二步再加入两个短引物进行扩增，最终得 码，翻译时无法得到特异性蛋白，从而就不能进行目 到目的基因。在引物Ｆｌ和Ｂ２的５ 端设计的ＮｄｅＩ 的蛋白的表达。和ＸｈｏＩ位点就是为了使基因定向插入ｐＥＴ表达载 体，得到阳性克隆，实现原核表达。 本实验从大豆基因组ＤＮＡ克隆得到ＰＡＬ基 因的２个外显子，通过ＳＯＥ的方法拼接成完整的 本实验中用Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶克隆到两个外 ＰＡＬ基因，与从ｍＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ的技术路线 显子后，采用了关键的高保真Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合 相比，简化了克隆方法，节约了成本。首先大豆总 酶，此酶具有３ 一５ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ的耐热活性，在 ＲＮＡ和ｍＲＮＡ的提取要比ＤＮＡ的提取严格得 ＰＣＲ扩增产物的３ 端不加碱基Ａ，而且非特异带得 多，而且操作容易受到污染使ＲＮＡ降解；其次从 维普资讯 http://www.cqvip.com
３期 宋柬等：ＳＯＥ法对大豆苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）基因拼接的应用研究 Ｚ３３ ｍＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ所需的反转录酶及相应的试 ６ Ｆ．Ｍ．奥斯伯，Ｒ．Ｅ金斯顿，Ｊ．Ｇ．塞德曼等著．马学军，舒跃龙等 剂较昂贵；再次，ｅＤＮＡ克隆能实现原核表达，本实 验重组ＰＣＲ的扩增产物也已通过ｐＥＴ系统在大肠 杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中实现原核表达，内容另作他叙。 此外，ｓＯＥ的成功应用，提供了一条非依赖ｅＤＮＡ （译校）．精编分子生物学实验指南［Ｍ］．北京：科学出版社， ２００５：５４—５５． ７ Ｙａｎｇ Ｙ．Ｓ，Ｗａｔｓｏｎ Ｗ．Ｊ，Ｔｕｃｋｅｒ Ｐ．Ｗ，Ｃａｐｒａ Ｊ．Ｄ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｂｙ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｃｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１（８）：１８８９—１８９３． ８ Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．ＰＣＲ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． 的和ＰＡＬ相似结构基因的克隆方法，也为后期的蛋 白质进化工程提供了可行的方法。 参 考 文 献 １ Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ，Ｃａｉ Ｚ．Ｌ，Ｈｏ Ｓ．Ｎ，Ｐｅａｓｅ Ｌ．Ｒ．Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏ— ｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ｔａｉｌｏｒ－ｍａｄｅ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９０，８（５）：５２８—５３５． ＳＯＥｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｔａｉｌｏｒ－ｍａｄｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．１９９５．３ （２）：９３—９９． ９ Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ． ＳＯＥｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｔａｉｌｏｒ－ｍａｄｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏ１．１９９７。 ６７ １４１—１４９． １０ Ｃｈｅｎ Ｑ．Ｚｈｕ Ｄ．Ｙ，Ｌｕｏ Ｘ．Ｄ，Ｊｉａｎｇ Ｙ，Ｊｉａｎｇ Ｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐ— ｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＦＰ１０—．ＥＳ－． ＡＴ一６ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ｇｈｏｎｇｈｕａ Ｊｉｅｈｅ Ｈｅ Ｈｕｘｉ Ｚａｚｈｉ．２００４．２７ （４）：２４４—２４８． ２李德葆，徐平．重组ＤＮＡ的原理和方法［Ｍ］．杭州：浙江科学技术 出版社１９９４：４０３—４０５． １１ Ｗａｎｇ Ｊ．Ｊ，Ｇｒｅｅｎｈｕｔ Ｗ．Ｂ，Ｓｈｉｈ Ｊ．Ｃ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｉｎ ａｓｐｏｒｏ— ３张学敏．王宜强．靶向新基因的分子克隆策略一理论与方法［Ｍ］． 北京；军事医学科学出版社，１９９９；６９—７３． ４周鹏，董克家．利用套叠ＰＣＲ技术进行基因突变和拼接［Ｊ］．生命 科学研究，２００１，５（１）：５２—５５． ｇｅｎｌｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．２００５，９８（３）：７６１—７６７． １２ Ｘｕ Ｚ，Ｚｈｏｎｇ Ｚ，Ｈｕａｎｇ Ｌ。ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ一４ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘ— ５刘金龙，刘津，杨瑞锋，等．ＳＯＥｉｎｇ法在构建人瘦蛋白乳腺表达 载体中的应用［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００４，６；９Ｏ一９２． ｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２００６。１—９． ＡＰＬＬＩＣＡＴＩｏＮ ｏＦ ＧＥＮＥ ＳＰＬＩＣＩＮＧ ＢＹ ｏＶＥＲＬＡＰ ＥＸＴＥＮＳＩｏＮ ＯＮ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＰＨＥＮＹＬＡＬＡＮＩＮＥ ＡＭＭｏＮＩＡ ＬＹＡＳＥ（ＰＡＬ） Ｓｏｎｇ Ｊｉａｎ Ｍａ Ｈ ｕｉｑｉｎ。 Ｃｈｅｎ Ｓｈａｎｇｗｕ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｅｊｉｎｇ １０００８３； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｔｗｏ ｅｘｏｎｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ ｌｙａｓｅ（ＰＡＬ）ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｂｙ ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｇｅｎｅ ＳＯＥｉｎｇ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｅｎｅ ＳＯＥｉｎｇ ｗａｓ ａ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎｉｎｇ ｅＤＮＡ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ＳＯＥ；ｅＤＮＡ；Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ ｌｙａｓｅ（ＰＡＬ） 欢迎订阅《中国种业》 《中国种业》是由农业部主管，中国农业科学院作物科学研究所、中国种子协会共同主办的专业技术期 刊。全国中文核心期刊、全国优秀农业期刊。覆盖范围：包括大田作物、蔬菜、花卉、林木、果树、草坪、牧草、 特种种植、种子机械等。读者对象：各级种子管理、经营企业的领导和技术人员，各级农业科研、推广部门人 员，大中专农业院校师生，农村专业户和广大农业生产经营者。 月刊，大１６开，每期定价５．８０元，全年６９．６０元。国内外公开发行，邮发代号：８２—１３２。漏订者可汇款 至编辑部订阅（汇款请注明刊期、详细通讯地址），邮寄挂号者需每期另加３元。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｉｎａｓｅｅｄｑｋｓ＠１６３．ｃｏｍ ｃｈｉｎａｓｅｅｄｑｋｓ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 地址：１０００８１北京中关村南大街１２号中国种业编辑部 电话：（０１０）６２１８６６５７ ６２１８０２７９ ６２１８０２５７传真：（０１０）６２１８０２７９
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