(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108279303 A(43)申请公布日 2018.07.13
(21)申请号 201810094598.3(22)申请日 2018.01.31
(71)申请人 珠海丽珠试剂股份有限公司
地址 519000 广东省珠海市香洲区同昌路
266号1栋、2栋、3栋、4栋(72)发明人 张晓红 曾敏霞 林燕清 (74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限
公司 44202
代理人 温旭(51)Int.Cl.
G01N 33/543(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页
(54)发明名称
一种抗体偶联羧化磁珠的方法
(57)摘要
本发明公开了一种抗体偶联羧化磁珠的方法，属于免疫检测学技术领域。该方法的主要步骤包括：洗涤羧化磁珠、加入EDC无水乙醇溶液活化羧化磁珠、加入抗体包被羧化磁珠、封闭和存储。本发明通过在有机相中进行羧化磁珠的活化，并对EDC无水乙醇溶液进行热处理，克服了在水相中应用EDC水溶液活化羧化磁珠而产生的EDC不稳定的现象，提高抗体偶联羧化磁珠过程的可操作性和可重复性，并可增强抗原抗体反应的反应性，操作简单，效果明显，为羧化磁珠在诊断试剂中的应用提供了新的思路，具有广阔的市场价值和应用前景。CN 108279303 ACN 108279303 A
权 利 要 求 书
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1.一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；2)弃上清，加入经过热处理的EDC无水乙醇溶液，振荡混匀；3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，振荡混匀。2.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤1)中的有机溶剂为DMF或DMSO。
3.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)的无水乙醇也可以是甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤2)中的EDC无水乙醇溶液的浓度为2.5～100mg/ml，优选为50mg/ml。
5.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤2)中热处理的条件为：将EDC无水乙醇溶液置于恒温箱中在25～65℃的温度下热处理0～24h。
6.根据权利要求5所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述热处理温度优选为55℃，热处理时间优选为4h。
7.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤3)中偶联时包被缓冲液体积与羧化磁珠的加入比例为2～18:1，优选为2:1。
8.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中的振荡混匀过程如下：置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡0.5～3h。
9.根据权利要求1所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：还包括步骤4)：向偶联抗体后的羧化磁珠中加入磁珠封闭液和赖氨酸，置于摇床上35～38℃下旋转1～3h。
10.根据权利要求9所述的抗体偶联羧化磁珠的方法，其特征在于：还包括步骤5)：向经过封闭的羧化磁珠加入磁珠工作液重悬，使羧化磁珠的浓度为80～150mg/ml，置于2～8℃下存储。
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CN 108279303 A
说 明 书
一种抗体偶联羧化磁珠的方法
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技术领域
[0001]本发明涉及免疫检测学技术领域，具体涉及一种抗体偶联羧化磁珠的方法。背景技术
[0002]随着抗原抗体免疫检测分析技术的突飞猛进，应用磁微粒作为抗原或抗体的载体来检测待测物已经成为生物领域主要的检测手段，其中表面修饰有羧基的羧化磁珠是常用的几种磁珠的类型之一。
[0003]在现有的技术方案中，主要应用乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的水溶液与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用来实现羧化磁珠与抗原或抗体的偶联，单独使用EDC水溶液也可实现羧化磁珠与抗原或抗体的偶联，只是偶联效率稍低。
[0004]专利CN104483477A公开了一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其中磁珠包被方法的步骤为：以MES buffer作为活化缓冲液，对表面有羧基的磁珠进行活化；以BST buffer作为缓冲液，将活化后的磁珠与单克隆抗体16A11/810进行偶联。但由于其应用的活化缓冲液为水溶液，EDC遇水不稳定，会大大降低其偶联效率，除了在保存和使用过程中应完全避免接触空气中的水分外，在配制水溶液的操作过程中要求也较高，不仅需要现用现配，而且不同配制批次之间的使用效率并不能够得到保证。发明内容
[0005]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗体偶联羧化磁珠的方法，该方法能够实现在应用EDC活化羧化磁珠的过程中避免羧化磁珠与抗体的偶联不受水分子的干扰，大大提高了羧化磁珠与抗体的偶联效率，操作简便高效，易于推广，具有较佳的市场前景。
[0006]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：[0007]一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其包括以下步骤：[0008]1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；[0009]2)弃上清，加入经过热处理的EDC无水乙醇溶液，振荡混匀；[0010]3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，振荡混匀。
[0011]作为本发明优选的实施方式，所述步骤1)中的有机溶剂为DMF(二甲基甲酰胺)或DMSO(二甲基亚砜)。
[0012]作为本发明优选的实施方式，所述步骤1)和步骤2)的无水乙醇也可以是甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种。
[0013]作为本发明优选的实施方式，所述步骤2)中的EDC无水乙醇溶液的浓度为2.5～100mg/ml，优选为50mg/ml。
[0014]作为本发明优选的实施方式，所述步骤2)中热处理的条件为：将EDC无水乙醇溶液置于恒温箱中在25～65℃的温度下热处理0～24h。
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说 明 书
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进一步优选地，所述热处理温度优选为55℃，热处理时间优选为4h。
[0016]作为本发明优选的实施方式，所述步骤3)中偶联时包被缓冲液体积与羧化磁珠的加入比例为2～18:1，优选为2:1。
[0017]作为本发明优选的实施方式，所述步骤2)和步骤3)中的振荡混匀过程如下：置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡0.5～3h。[0018]作为本发明优选的实施方式，本发明的方法还包括步骤4)：向偶联抗体后的羧化磁珠中加入磁珠封闭液和赖氨酸，置于摇床上35～38℃下旋转1～3h。[0019]作为本发明优选的实施方式，本发明的方法还包括步骤5)：向经过封闭的羧化磁珠加入磁珠工作液重悬，使羧化磁珠的浓度为80～150mg/ml，置于2～8℃下存储。[0020]相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0021]本发明所述的抗体偶联羧化磁珠的方法通过将EDC溶解于无水乙醇溶液中，并对EDC无水乙醇溶液进行热处理，在有机相中进行羧化磁珠的活化，克服了在水相中应用EDC水溶液活化羧化磁珠易受到水分子干扰而产生的EDC不稳定的现象，提高抗体偶联羧化磁珠过程的可操作性和可重复性，提高羧化磁珠与抗体的偶联效率，并可增强抗原抗体反应的反应性，操作简单，效果明显，为羧化磁珠在诊断试剂中的应用提供了新的思路。[0022]本发明所提供的方法工艺步骤简单，操作简便，易于推广，具有广阔的市场价值和应用前景。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。[0024]一种抗体偶联羧化磁珠的方法，其包括以下步骤：[0025]1)使用有机溶剂对羧化磁珠进行洗涤，然后再用无水乙醇洗涤羧化磁珠；[0026]2)弃上清，加入经过热处理的浓度为2.5～100mg/ml的EDC无水乙醇溶液，置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡30～60min，使其混匀；其中，热处理的条件为：将EDC无水乙醇溶液置于恒温箱中在25～65℃的温度下热处理0～24h；[0027]3)用包被缓冲液洗涤羧化磁珠，弃上清，加入包被缓冲液和抗体进行偶联，置于恒温振荡仪中在22～28℃下以800～1000rpm转速振荡1～5h，使其混匀；偶联时包被缓冲液体积(μl)与羧化磁珠(30μg/人份)的加入比例为2～18:1；
[0028]4)向偶联抗体后的羧化磁珠中加入磁珠封闭液和赖氨酸，置于摇床上35～38℃下旋转1～3h；
[0029]5)向经过封闭的羧化磁珠加入磁珠工作液重悬，使羧化磁珠的浓度为80～150mg/ml，置于2～8℃下存储。[0030]上述方法中，有机溶剂优选为DMF或DMSO；无水乙醇也可以是甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种。
[0031]发明人在现有技术的基础上，通过大量实验，发现了将EDC溶解于有机相中，并对其溶液进行热处理后，用于活化羧化磁珠，再进行偶联抗体的方法，能够使得羧化磁珠偶联抗体的效率不受水分子的干扰，提高EDC活化羧化磁珠的效率，从而提高抗体与羧化磁珠的偶联效率，并通过大量实验，优化了抗体偶联磁珠过程中的相关条件，为无论是单独使用
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EDC活化羧化磁珠还是联合使用EDC与NHS活化羧化磁珠，再进行抗体与羧化磁珠的偶联，都提供了全新的思路。[0032]实施例1：
[0033]1)先配制包被缓冲液、磁珠洗涤液、磁珠封闭液和磁珠工作液，备用；[0034]2)用有机溶剂DMF洗涤3mg羧化磁珠一次，再用无水乙醇洗涤羧化磁珠两次；[0035]3)用无水乙醇溶解EDC，使得EDC无水乙醇溶液的浓度为50mg/ml，并将EDC无水乙醇溶液放置于55℃恒温孵箱中进行热处理4h；[0036]4)向弃去上清的羧化磁珠中加入200μl偶联剂EDC无水乙醇溶液，充分混匀；置于恒温振荡仪上在25℃下以1000rpm的转速振荡40min；[0037]5)用1.8ml包被缓冲液洗涤羧化磁珠两次；
[0038]6)向上述洗涤后弃去上清的羧化磁珠中加入200μl包被缓冲液，再加入所需包被量的AFP抗体，充分混匀，包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份，100人份)的加入比例为2:1；置于恒温振荡仪上在25℃下以1000rpm的转速振荡3h；[0039]7)用1.8ml包被缓冲液洗涤羧化磁珠两次；
[0040]8)向上述洗涤后弃去上清的羧化磁珠中加入1.8ml磁珠封闭液和10mM赖氨酸，置于摇床上在37℃下旋转1.5h；
[0041]9)将羧化磁珠重悬在磁珠工作液中，配制成120mg/ml的工作浓度，存储在2～8℃的环境中。
[0042]实施例2：
[0043]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的浓度为2.5mg/ml外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0044]实施例3：
[0045]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的浓度为100mg/ml外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0046]实施例4：
[0047]与实施例1相比，除了包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例为18:1外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0048]实施例5：
[0049]与实施例1相比，除了包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例为6:1外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0050]实施例6：
[0051]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为25℃、热处理时间为0h外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0052]实施例7：
[0053]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为25℃、热处理时间为4h外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0054]实施例8：
[0055]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为65℃、热处理时间为4h外，本实施例的其他条件与实施例1相同。
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实施例9：
[0057]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为55℃、热处理时间为1h外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0058]实施例10：
[0059]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为55℃、热处理时间为24h外，本实施例的其他条件与实施例1相同。[0060]对比例1：
[0061]与实施例1相比，除了将EDC溶解于水相中，并在水相中活化羧化磁珠外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0062]对比例2：
[0063]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的浓度为1mg/ml外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0064]对比例3：
[0065]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的浓度为200mg/ml外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0066]对比例4：
[0067]与实施例1相比，除了包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例为30:1外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0068]对比例5：
[0069]与实施例1相比，除了包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例为1:1外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0070]对比例6：
[0071]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为16℃、热处理时间为4h外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0072]对比例7：
[0073]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为75℃、热处理时间为4h外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0074]对比例8：
[0075]与实施例1相比，除了EDC无水乙醇溶液的热处理温度为55℃、热处理时间为48h外，本对比例的其他条件与实施例1相同。[0076]效果验证：
[0077]下面分别通过实验测定实施例1～10和对比例1～8的发光值，以验证本发明所提供的方法的技术效果。[0078]一、有机相与水相对比
[0079]在化学发光仪测试筒中分别加入250μl包被有抗体的羧化磁珠和350μl检测抗体的酶标记物，应用化学发光仪检测不同浓度待测标准品的发光值，标准品的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml，待测标准品的加样量为20μl，记录化学发光仪检测的发光值，结果见表1和表2。
[0080]表1在有机相中重复三次包被羧化磁珠
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表2在水相中重复三次包被羧化磁珠
由表1和表2可知，实施例1的发光值较好：在有机相中应用50mg/ml EDC无水乙醇
溶液活化羧化磁珠，重复三次检测待测标准品，结果三次测得的反应性非常稳定，发光值偏差均未超过10％。而对比例1采用在水相中应用50mg/ml EDC水溶液活化羧化磁珠，重复三次检测待测标准品，结果三次测得的反应性极不稳定，发光值最高相差3倍以上。由此可见，本发明在有机相中应用50mg/ml EDC无水乙醇溶液活化羧化磁珠，能够使得羧化磁珠偶联抗体的效率不受水分子的干扰，提高EDC活化羧化磁珠的效率，从而提高抗体与羧化磁珠的偶联效率。[0085]二、EDC无水乙醇溶液浓度对比[0086]同样地，在化学发光仪测试筒中分别加入250μl包被有抗体的羧化磁珠和350μl检测抗体的酶标记物，应用化学发光仪检测不同浓度待测标准品的发光值，标准品的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml，待测标准品的加样量为20μl，记录化学发光仪检测的发光值，结果见表3。[0087]表3EDC无水乙醇溶液浓度对比
[0088]
[0084]
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由表3可知，本发明通过优化EDC无水乙醇溶液的浓度，选择浓度范围是2.5～
100mg/ml，实施例1的效果较好，反应性最高可提升70％以上，而对比例2和对比例3采用的条件1ng/ml和200ng/ml，效果较差，反应性低至80％以下。[0090]三、包被缓冲液体积与羧化磁珠加入比例对比[0091]同样地，在化学发光仪测试筒中分别加入250μl包被有抗体的羧化磁珠和350μl检测抗体的酶标记物，应用化学发光仪检测不同浓度待测标准品的发光值，标准品的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml，待测标准品的加样量为20μl，记录化学发光仪检测的发光值，结果见表4。[0092]表4包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)比例
[0093]
[0094]
由表4可知，本发明通过优化羧化磁珠偶联抗体过程中包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例，选择比例范围是2～18:1，实施例1取得的效果较好，反应性最高可提升50％左右，而对比例4和对比例5采用的条件30：1和1:1，效果较差，反应性低至60％-70％左右。[0095]四、EDC无水乙醇溶液热处理条件对比[0096]同样地，在化学发光仪测试筒中分别加入250μl包被有抗体的羧化磁珠和350μl检测抗体的酶标记物，应用化学发光仪检测不同浓度待测标准品的发光值，标准品的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml，待测标准品的加样量为20μl，记录化学发光仪检测的发光值，结果见表5。[0097]表5EDC无水乙醇溶液热处理条件
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由表5可知，本发明通过对EDC无水乙醇溶液进行热处理，热处理温度范围是25～
65℃，热处理时间范围是0～24h，可提高羧化磁珠与抗体的偶联效率，实施例1取得的效果较好，55℃、4h条件下，与未进行热处理组相比，反应性可提高2.5倍左右，而对比例6～8采用的条件16℃4h、75℃4h和55℃48h，效果较差，与未进行热处理组相比，反应性低至30％以下。
[0100]综上所述，本发明提供的方法通过将EDC溶解于无水乙醇溶液中，在有机相中进行羧化磁珠的活化，以实现在应用EDC活化羧化磁珠后羧化磁珠偶联抗体的效率能够不受水分子的干扰，提高了不同批次包被羧化磁珠的可操作性和可重复性。在水相中重复三次包被羧化磁珠后，反应性的偏差可高达到3倍以上，而在有机相中重复三次包被羧化磁珠后，反应性的偏差小于10％；本发明通过优化EDC乙醇溶液的浓度，反应性最高可提升70％以上；通过优化羧化磁珠偶联抗体过程中包被缓冲液体积(μl)与磁珠人份数(30μg/人份)的加入比例，使得反应性提高了50％左右；并通过对EDC无水乙醇溶液进行热处理，提高了羧化磁珠与抗体的偶联效率，EDC无水乙醇溶液经过最优条件的热处理后活化羧化磁珠再用于偶联抗体，其反应性最好可提高2.5倍左右。
[0101]上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
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