用于RNA干涉的siRNA的设计与合成

维普资讯 http://www.cqvip.com 科『苑ｌ论『谈　白莉杨忠亮李荣田　科　用予ＲＮＡ干涉的ｓｉＲＮＡ的设计与合成　（黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨１５００８０）　摘要：ＲＮＡ干涉是近年来分子生物学技领域的研究热点之一。对ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）的合成方法以及设计原则进行了归纳总结．　并应用此原则根据ＧｅｎＢａｎｋ上拟南芥ｆｉｅ基因ｃＤＮＡ保守区设计了３对２１ｎｔ的寡核苷酸序列，加上８个与１ｖ７启动子引物３　端匹配的碱基序列　ＣＣＴＧＴＣＴＣ，经过体外转录等一系列反应，获得３条用于ＲＮＡ干涉的ｓｉＲＮＡ。　关键词：ＲＮＡ干涉；ｓｉＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ　近年来研究发现，一些小的ｄｓＲＮＡ可以通　合成ｓｉＲＮＡ序列，利用显微注射方法导人受体植　根据ｓｉＲＮＡ设计原则设计了针对拟南芥ｆｉｅ　过抑制同源ｍＲＮＡ翻译，高效、特异的阻断体内　株，观察干涉现象。　基因的３对２１ｎｔ的寡核苷酸，体外转录合成了三　特定基因的表达，称为　ＮＡ干涉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒ—　１实验方法　条２１ｎｔ的ｓｉＲＮＡ。凝胶电泳分析结果如下：　ｅｎｅｅ，ＲＮＡｉ）　此技术有其它反向遗传学技术所　１Ａ实验材料　无法比拟的优点，并且在基因功能鉴定、疾病诊　从Ｇｅｎｂａｎｋ上发表的拟南芥ｆｉｅ　ｃＤＮＡ序列　断、疾病治疗等领域具有极其广阔的应用前景。由　中寻找保守序列，设计了３对２９ｎｔ寡核昔酸序　于实验对象和条件不同，ｓｉＲＮＡ的合成方法也大　列，包括８个与１ｖ７启动子引物３　端匹配的碱基　有不同。目前，用于ＲＮＡｉ的ｓｉＲＮＡ的合成方法　序列和２１ｎｔ的ｓｉＲＮＡ序列。　１．１，１Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ：５　一ＡＡＴｒＧＴＣＴＣＧ—　有５种：ａ．化学合成ｄｓＲＮＡ片段：Ｎ，Ｎ寡核苷酸合　　成仪合成，经过ＨＰＬＣ纯化。ｂ．体外转录：预先合　ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ－３’成好所需的ｄｓＤＮＡ，利用ＲＮＡ聚合酶进行体外　Ｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ：５　一ＡＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＡ—　ＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣ一３　转录。目前有实验室按照此方法成功的达到了干　１．１２Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ：５　－ＡＡＣＣＣＡＴＡＴ—　涉基因表达的效果Ⅲ。ｃ．利用ＲＮａｓｅⅢ体外消化大　片段ｄｓＤＮＡ：预先扩增出目的基因的一段ｍＲ—　ＧＴＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ～３　４讨论　Ｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ：５　－ＡＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＡ—　ＮＡ，后利用ＲＮａｓｅｌ￣随机切割出大量的ｄｓＲＮＡ，　正义和反义的ｓｉＲＮＡ模板应分别转录２ｈ。　ＣＡＴＡＴＧＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣ一３　从中获得潜在目的ｓｉＲＮＡ。ｄ－构建载体体内转录　混匀过夜，分别转录消除模板之间的竞争。因为转　表达：在表达载体内克隆一段与目的ｓｉＲＮＡ对应　１．１．３Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ：５　－ＡＡＧＡＴＡＣＣＣＧ—　录试剂限制二倍体ｓｉＲＮＡ２条链中一条链的合　ＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣ一３　的ｄｓＤＮＡ，然后利用载体上的ｎＮＡ聚合酶Ⅲ启　成。并且体外转录合成的ｄｓＲＮＡ有５　突出引导　动子在体内转录出目的ｓｉＲＮＡ。ｅ．ｓｉｔｔＮＡ表达框：　Ｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ：５　－ＡＡＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＣ—　序列，必须在转染前去除，引导序列被特定的核糖　ＣＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣ一３　利用ＰＣＲ技术扩增出一段表达框，它包括一个　核酸酶降解。在消化反应中ＤＮＡ模板被ＤＮａｓｅ　ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子，一段发夹结构ｓｉＲＮＡ，以　１－２试剂　降解。结果ｓｉＲＮＡ中有核苷酸，酶，小的低聚物，　及一个ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子的终止子日。　Ａｍｂｉｏｎ公司的ＳｉｌｅｎｃｅｒＴ￣ｓｉＲＮＡ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃ—　须经盐酸纯化过柱后，才能应用于后续实验。　以上几种方法适用的操作对象不同，各有优　ｔｉｏｎ　Ｋｉｔ。　总之，应用该优化方法合成的ｓｉＲＮＡ进行　巩　，应用也不相同。前三种是体外转录制备目的　２９ｎｔ寡核苷酸序列上海生工合成，浓度　ＲＮＡ干涉时，得到了良好的预期效果。在科技迅　２０Ｄ。　ｓｉＲＮＡ，可通过转染，电转化、注射等方法导人受　猛发展的时代，ＲＮＡｉ技术在抑制基因表达，鉴定　体内来达到干涉目的。后两种是人工构建表达载　２实验方法　基因功能等方面开辟了一条新的研究途径，但由　体或表达框，导人受体后进行体内转录，从而获得　２．１　Ｔ７启动子引物和２９ｎｔ寡核苷酸杂交　于其机理尚不十分清楚，因此对其的研究尚处于　２　Ｌ　Ｔ７　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ、６　Ｌ　ＤＮＡ　Ｈｙｂ　目的ｓｉＲＮＡ进行基因干涉。　摸索阶段。　Ｂｕｆｆｅｒ、２　ＩＬＬ　ｓｅｎｓｅ　ｏｒ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　由于ＲＮＡｉ的原理和机制目前为止并不十　参考文献　分清楚，各实验室ｓｉＲＮＡ的设计也不尽相同，但　（１００ｕＭ）。７０￣Ｃ水浴５ｒａｉｎ，室温放置５ｒａｉｎ。　［１傍　婺洲，Ｂｏｄｍｅｒ　Ｒ，朱传炳，等利用ＲＮＡｉ技术　多数用于ＲＮＡｉ的ｓｉＲＮＡ的设计应遵循于以下　２．２双链寡核苷酸模板的合成　研究果蝇心脏发育基因的功能叨．遗传学报，　原则：ａ．ｓｉＲＮＡ的序列应当选择靶基因的外显　２１ｘＬ　１０Ｘ　Ｋｌｅｎｏｗ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、２　ｔｚＬ　２ｏ０２．２９（１）：３４－－３８．　１　０Ｘ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ、４　Ｌ　Ｎｕｅｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ、２　子序列，而且要避免选择位于５　ＵＴＲ和３　ＵＴＲ　『２］Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ　Ｄ，Ｌｉ　Ｈ，Ｒｏｓｓｉ　ＪＪ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＲＮＡ，　以及距离起始密码和终止密码很近的地方。ｂ．　ｕＪＬ　Ｅｘｏ＿Ｋｌｅｎｏｗ。３７屯温浴３０ｒａｉｎ。　ｓｉＲＮＡ长度为２１ｎｔ一２３ｎｔ￣ｊ。且３　末端带有２个　２－３模板寡核苷酸的反转录　２００２，８（１１）：１４５４－１４６０．　２¨Ｉ　ｓｅｎｓｅ　ｏｒ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｓｉＲＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ、４　碱基突出，起始序列为ＡＡ。ｃ避免连续３个Ｇ，　『３】Ｚａｍｏｒｅ　Ｐ　Ｄ，Ｔｕｓｃｈｌ　Ｔ，Ｓｈａｒｐ　Ｐ　Ａ，ｅｔ　ａ１．　＝ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ＡＴＰ－ｄｅ—　因为ｐｏｌｙＧ会形成四聚体，为超稳定结构，影响　ＩｘＬ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ、１０¨Ｌ　２Ｘ　ＮＴＰ　Ｍｉｘ、　ＲＮＡｉｚＬ　１０Ｘ　Ｔ７　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、２“Ｌ　Ｔ７　Ｅｎｚｙｍｅ　ｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　ａｔ　２１　ｔｏ　２３　ｎｕ—　干涉效果。ｄ．Ｇ—Ｃ含量好在４５～５５％之间。ｅ．　２ｔｍＲＮＡ的二级结构对干涉无明显影响。￡记录　Ｍｉｘ。３７℃温浴２ｈ。　ｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ叨．Ｃｅｌｌ，２０００（１０１）＂．２５－３３．　ＡＡ及其下游其３　端１９ｎｔ的序列并与基因组数　２．４正义链和反义链互补杂交：３７℃温浴过　［４ｌｒｕｓｃｈｌ　Ｔ，Ｚａｍｏｒｅ　Ｐ　Ｄ，Ｌｅｈｍａｎｎ　Ｒ，ｅｔ　ａＬＴａｒ—　ｇｅｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　据库进ＢＬＡＳＴ比对分析，排除与目的基因外的　夜。　其它基因明显同源的靶位点。ｇ．为确保得到良好　２．５　ｓｉＲＮＡ纯化　ＲＮＡ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，１９９９，１３：３１９１—３１９７．　的干涉效果，一般针对一个基因的不同区域设计　２．５．１消化模板ｄｓＤＮＡ和ｓｓＲＮＡ（向２－４反应　［５］Ｍｌｏｔｓｈｗａ　ｓ，Ｖｏｉｎｎｅｔ　Ｏ，Ｍｅｔｔｅ　Ｍ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．ＲＮＡ　３－４个不同ｓｉＲＮＡ。　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｓｉｌｅｎｃｅ　ｓｉｇｎａｌ　．Ｐｌａｎｔ　液中添加）　６　ＩＬＬ　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、４８．５１ｘＬ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ—　ｃｅｌｌ，１４，ｓ２８９—３０１．　由于该实验窒是从事植物分子生物学方面　的工作，考虑到植物转基因操作较为繁琐、且周期　ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ、３１ｘＬ　ｌｔＮａｓｅ、２＿５“Ｌ　Ｄｎａｓｅ。３７℃温浴　作者简介：白莉（１９８０～），女，黑龙江哈尔滨　长，而且有实验证明将一个表面吸附有５００ｂｐ基　２ｈ。　人，硕士研究生．主要研究方向：生化与分子生　因片段的金属片插人植株，引起了整个植株强烈　２．５．２向上一步反应混合体系中加人４００ｕｌ　物学。　的共抑制现象　。并且当植物局部发生ＲＮＡ干涉　的ｓｉＲＮＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ，室温放置２￣Ｓｍｉｎ。　基金项目：国家转基因植物研究与产业化　现象后，ＲＮＡ沉默信号可以被系统的传递给整个　２．５＿３过柱纯化　开发专项资助项目（ＪＶ０３一Ａ一２４０２）。　３结果　植株目。所以该实验计划利用体外转录的方法人工　一２７—