电子显微镜与超薄切片技术

电子显微镜与超薄切片技术

第一章 电子显微镜

电子显微镜的出现大大地推进了生物科学的研究，使生物科学从宏观到微观，从显微水平发展到超显微水平；将形态和组成，结构和功能逐渐地交融起来，使人们对细胞内的超显微结构及其功能得到进一步的认识。目前，电子显微镜已达到对物质元素构成的最小单位一一原子的分辨，在生物学、材料学、冶金学、考古学、地学和矿物学等学科占有极重要的地位。就生物学而论，电子显微镜及随之发展起来的电子显微技术，在细胞生物学、细胞化学、分子生物学、分子遗传学、分子免疫学、病毒学、微生物学、生物化学、生物医学等许多分支领域中起着不可忽视的，有时是决定性的作用。

电子显微镜，除了通常所指的透射电镜外，还发展了扫描电镜、高压电镜以适用于各种目的研究，但它们的结构大同小异，下面仅就透视电镜的结构及原理择要介绍。

第一节 透视电镜的结构

透视电镜的整体包括：电子光学系统，真空系统，供电系统（高压电源、透镜电源、控制电路、微机等电子学线路）、水冷却循环系统和压缩气流系统。

一、电子光学系统

电子光学系统又称镜筒，为电镜的主体结构。考虑到机械的稳定性，大都制成直立式的，镜筒是由照明系统、样品室、成像系统、观察记录系统等组成的。

1.照明系统

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位于镜筒的最上端，由电子枪和二个磁透镜组成。电子枪的主要作用是发射电子束，它是由阴极、阳极和栅极组成的。阴极是电子的来源，它是一个直热式的钨灯丝，利用电流通过产生电子，阳极和栅极在高压（10万伏）和负高压（1～2千伏）的作用下将电子聚成一束很细的电子束。因此电子枪相当于光学显微镜的光源。磁透镜是由一只大的电磁线圈组成的。当电流通过线圈时，就会产生电磁场，当电子通过时，由于磁场作用使电子发生会聚作用。这样电子枪产生的电子束，在两个磁透镜的作用下，把它会聚成一个只有几微米大小的电子束斑，并使电子束斑具有足够的亮度。因此磁透镜具有聚“光”的作用，所以这两个磁透镜又称为聚光镜。

2.样品室

在聚光镜的下面，用来放置观察的物体。由于电子束只能穿透很薄的物体，所以样品要制得很薄，一般只有几百埃，当电子束穿过标本后，使电子束发生散射，这些散射的电子进入了电子显微镜的成像系统。

3.成像系统

由三个磁透镜组成。第一个是：物镜，对穿过标本后的散射电子进行第一次成像和放大；它直接决定电镜的分辨本领，对成像水平起关键性影响；第二个是中间镜，将成像的物体图像进行放大；第三个是投影镜，将物像进行第三次放大，并把放大了的图像投射到荧光屏上去。

4.观察记录系统

肉眼是不能直接看见电子射线所构成的像，必须将其转换成可见光的形式才易识到，

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这种转换是由观察室内的荧光屏来实现的，当快速运动的电子落在荧光屏上，激发荧光物质而发生光亮度，由于样品对电子的散射作用，落在屏上的电子分布不均匀性则造成荧光屏发光强度的不均匀分布（反差），即形成电子显微图像，在观察室内还安装了图像记录设备──照相装置，以把瞬息即失的电子显微图像记录下来。

二、真空系统

电子显微镜必须在高度的真空条件下进行工作，否则空气中的分子会阻挠电子束的发射而不能成像，阴极与阳极之间会放电，灯丝也会受到氧化或被阳离子轰击而减短寿命。所以在镜筒下面装有一套真空系统，它是由低真空抽气泵，高真空油扩散泵和电磁阀等组成的。

三、供电系统

电子显微镜为了获得高的分辨本领，要求供电系统稳定地供给电子枪、磁透镜所需要的高压和激磁电流，所以要有一套复杂的电子稳压、稳流电流。

第二节 透视电镜的成像原理

电镜是用波长比光波长短十几万倍的电子束作照明源，当电子枪的阴极发射电子，在高压加速场作用下，经聚光镜会聚成束，以高速射向薄样品。入射电子束和出射电子束对样品信息的传递过程主要由于入射电子与样品原子的散射机制，而使成像电子束（出射束）不均匀，相应于样品上质量密度高的区域，入射电子会被样品吸收，而出射束会是电子数不足或没有出射电子。反之，质量密度低的区域散射程度小，透过样品的电子多，这样一来，整个出射电子束经物镜折射放大，最后落到荧光屏上，即形成许多明暗程度不同的区

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域，它们反映了样品的结构信息。把荧光屏上亮度分布不均匀现象称反差，所获得的图像称为衬度像。

此外，为了提高像的清晰度，在物镜的中心，样品下方插入一支光束，称“物镜光阑”，由于它主要是用来提高反差的，又称“反差光阑”，光阑上的孔径有30、50、150微米三种，装成活动的，用一根光阑支架调节，以便根据实际需要进行选择。

第三节 电镜的分辨本领、放大倍数、反差及度量单位

研究物体“微细结构”最直观的方法，就是将物体“放大”、然后观察放大了的像，以便人肉眼觉察出更多的细节，像对物体的放大倍数就是显微镜的放大倍率。观察放大的像会改进人眼对物体的分辨能力，显然分辨与放大倍数是密切相关的。

分辨本领是衡量一台显微镜的性能优劣程度的指标，即能够清楚地辨认物体细节的能力，通常以能分清两点的最小间距γ来度量。γ愈小，能分清的物体细节愈细微，则分辨本领就愈高。一般情况下，人眼的分辨本领为0.2mm，比这个距离更小的细节就无法分辨了，要用放大镜等放大到眼睛可觉察的程度。因此显微镜的放大倍数(M)应为：

γ眼

Ｍ＝ ────

γ仪

例如：电镜的分辨本领γ仪＝２埃（A°），人眼的γ眼＝0.2mm，则

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M = 0.2 ×107／2 = 106倍，1埃 = 10-1 nm

即人眼要能够分辨清楚２个埃的细节，就必须将图像放大到一百万倍才能观察。

一台显微镜的分辨本领，与实际分辨率有一定的差距，这不仅与仪器的调节有关，更重要的因素来自标本性质的好坏，细节的形状和位置以及要分辨的细节的反差条件等。显微镜下的放大图像中，细节与背景在明暗亮度上的差别，直接影响着人眼对细节的辨认效果，明暗差别愈大，愈容易辨认。一台显微镜即便具有很高的分辨本领，如果像的反差不明显，企图判断被观察物体的结构细节就必将发生困难。因此一幅清晰的放大图像的获得，不但要有高的分辨率，而且要有足够的明显的反差。

光学显微镜的长度单位是“微米”以符合“μｍ”表示，这个单位对电镜而言是太大了，电镜用的长度单位是“埃”以符号“A°”表示。不过现代国际长度中“埃”已由10-1nm所代替。1A°＝10-1 nm＝10-4μｍ＝10-7 mm＝10-10 m文献资料中常见到的显微照片上标的尺度，有的是“μｍ”，有的是“ｎｍ”。根据这些标尺便可换算出该照片的放大倍数。

例如，从标尺实际测量长度为1cm，而照片上标尺的标数为0.1μｍ，所以照片的放大倍数为：Ｍ＝108／103＝105 倍（10万倍）

第二章 电镜超薄切片标本的制备

生物超薄切片技术是继电子显微镜出现后发展起来的，它原则上与光学显微镜石蜡切片技术相似，但是由于电子显微镜的结构特点，电子束只能穿透特别薄的标本（0.1微米以下），另一方面电子显微镜具有很高的分辨能力和放大能力，研究是在超显微水平的领域中进行的，因此，对制片技术上，要求更高更严格，操作须更细致。

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第一节 固定

和光学显微镜标本制备一样，通过固定把组织或细胞以至细胞内的细胞器，真实地保存下来。而电子显微镜要求更严格，要求在超微结构方面尽可能保持细胞原有的精细定位。因此组织必须在动物杀死的几分钟内立即固定，使细胞及其周围的半液态内含物立即凝结，每种细胞器及其所附的大分子，一如活时那样尽可能如实保存下来。而且还要防止组织在固定之后以及脱水包埋等过程中不致改变和损害结构以至丢失细胞的组份。要做到这点是比较困难的，因为动物是一个整体，体内任何一部分组织甚至细胞都是整体的一个组成部分，动物受到外来刺激，那怕是麻醉，甚至暴杀都会通过神经传导，而引起全身各部分的反应。这些反应，可以直接由神经组织产生，也可以在中枢神经系统的支配下引起内分泌的改变而产生的。这许多复杂的反应过程；都能够反映到细胞的超显微结构的变化上。这就向我们提出一个如何杀死动物和固定组织的问题，有人主张用麻醉剂来麻醉动物致死或轻微麻醉活取，有的主张暴死。无论用何种方法都要求“快”，力争在处死动物几分钟内将组织浸入固定液，切取的组织块要“小”，一般不超过1mm。用锐利的刀片，垂直往下切，不要拉、锯、压，避免细胞受损伤。动物组织的血液供给停止后，很快会发生自溶现象，这是因为细胞内的各种酶释放出来， 使蛋白、核酸迅速降解。为了降低酶的活性，要求在“低温”条件下(0—4℃)操作。固定液、容器和器械应预冷。

最理想的固定液是既能很好地保存细胞内所有内含物，又能迅速地渗过细胞外的介质和细胞质膜，而达到整个细胞的固定。目前认为比较好而且使用最广泛的是四氧化锇，但其渗透率很慢，更多的是采用先后两次固定方法，第一次固定大都使用戊二醛固定液，经过充分洗涤后，用锇酸作第二固定（即后固定），后固定的时间和温度都和前固定相同。固定液通常是配制在缓冲液中，以稳定由于固定液和细胞体液接触时释放出氢离子而改变pH值。此外，缓冲液的另一作用，是以其盐类来增加和维持固定液的渗透压。

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固定的时间，则是根据组织的类型和性质，组织块的大小，温度以及固定液的组成而定。例如，单细胞，只需几分钟，而对于较大的组织，尤其是致密的组织，则要长达一小时甚至更长的时间。

固定液的性能和配制：

戊二醛：戊二醛（C5H8O2），市售戊二醛一般为25%的水溶液，pH4.0—5.0，pH降至3.5以下就不能使用。戊二醛具有２个醛基，对细胞结构具有很活跃的亲和力，是一种良好的固定液。其主要优点是，能较好地保存蛋白质、糖原；对微管及膜结构均有较好的保存能力；对组织的渗透力大，固定速度快；能保存某些酶的活力，有利于细胞化学研究。缺点是，对脂质不起固定作用：不起电子染色作用、反差较差；对缓冲液要求高，固定效果与缓冲液有很大的关系。

配制磷酸缓冲戊二醛固定液(pH7.4)

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戊二醛最终浓度 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0

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0.2M磷酸缓冲液(ml) 50 50 50 50 50 50

25%戊二醛水溶液(ml) 4 6 8 10 12 16

重蒸水加至 (ml) 100 100 100 100 100 100

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四氧化锇（OsO4）：又名锇酸，为淡黄结晶。锇酸极毒，一般密封于0.5-1克装安瓿瓶里，其蒸汽也有固定作用，对人的眼睛、角膜、表皮细胞及口腔粘膜表皮细胞特别有害，因此使用时应特别小心，必须在强通风条件下或通风橱内操作。四氧化锇是电镜标本固定液中较好的一种，其优点是：与蛋白质发生化学结合时形成交联而不是沉淀作用，因此能较完好地保存生物微细结构，是脂类物质良好的固定剂，还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定，即不使组织收缩，又不使组织膨胀，能很好地保持细胞结构形态；有强的电子染色作用，固定后的样品有较好的反差。缺点是：对糖原、核酸、微管固定效果较差，分子较大扩散慢，因而穿透力差，大于1mm3的组织块不能得到完好的固定，长时间停留在锇酸中会使组织变脆，造成切片困难，所以锇酸固定时间不宜过长，一般以1—4小时为宜，不适宜进行细胞化学研究。

2%锇酸原液的配制：打破有固体四氧化锇的安瓿瓶，将之放进干净的棕色玻璃塞的瓶子内，加1.0M磷酸缓冲液（pH7.4），至所需的最终浓度，锇酸需要一些时间才能溶解，所以固定液要至少在使用前一天配制。在室温下，固定液能保存数周，最好密封置于暗处。

第二节 脱水

组织经过固定后，下一步骤是脱水，目的是使包埋剂更好地浸透到细胞的各个部分。脱水剂有乙醇、丙酮、乙二醇、氧化丙烯、水溶性环氧树脂等。最常用的是乙醇和丙酮两种，大多数环氧树脂是能够溶于酒精和丙酮的，而和氧化丙烯溶解的更好，所以用乙醇或丙酮脱水的材料，在浸入环氧树脂前先用氧化丙烯作为中间溶剂，过渡一下。

固定标本在脱水之前，先用缓冲液洗涤数次，以除去多余的固定液，用戊二醛固定的

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组织可用缓冲液洗数小时，也可保存在缓冲液内几周甚至几个月。

组织脱水可在室温下进行，又可在冷冻（0℃）下进行，一般脱水程序：

50% 乙醇或丙酮 10分钟

70% 乙醇或丙酮 10分钟

85% 乙醇或丙酮 10分钟

95% 乙醇或丙酮 15分钟

100% 乙醇或丙酮 15分钟

100%乙醇或丙酮 15分钟

中间溶剂 10分钟

中间溶剂 10分钟

脱水一定要干净，如果要加速脱水过程，组织块要小（0.1-0.3mm3）。整个脱水过程时要摇动组织，脱水剂要多些，每一级脱水剂要更换几次新液。

第三节 包埋

一、浸透

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浸透过程是在脱水之后和包埋之前进行的，实际上是包埋过程的一部分。浸透得好坏，是与包埋的最后结果密切相关的，浸透剂就是包埋剂，浸透的目的是为了把包埋剂填充到组织或细胞的各个部分，使得切片时细胞及其精细结构不致受到损伤和碎裂，以达到尽可能完整地保存。

二、包埋剂

电子显微镜目前最常用的包埋剂是环氧树脂，环氧树脂为热塑性树脂，俗称万能胶，是蜜黄色半液体，它和一定的硬化剂作用后在温度作用下形成不可递性的交链的黄棕色固体，国外一般常用的环氧树脂为Epon812，国产树脂618也已广泛使用。

包埋剂的配方：

1.Epon812

现广泛地使用在电子显微镜的组织包埋。它的粘度低，穿透组织快，加上硬化剂和加促剂能在低温下比较容易均匀地硬化，和Epon812配合，常用的硬化剂有DDSA（十二烷基琥珀）和MNA（甲基丙次甲基邻苯二甲酸酐），加促剂是DMP—30（2,4,6 一二甲氨基甲基苯酚）。

（１）Luft包埋剂（1961）：

Ａ液：Epon812 5ml

DDSA 8ml

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Ｂ液：Epon812 8ml

MNA 7ml

混合包埋剂：

Ａ液 13ml

Ｂ液 15ml

DMP - 30 16滴

此配方对动物和植物都适用。

（２）Epon812包埋剂

Epon812 4ml

DDSA 1ml

MNA 3ml

DMP-30 0.16ml

此配方简便适用，于60℃下24小时聚合完全。在配制时先混合前三种液体，在烧杯中用玻璃棒不断地搅拌直至呈麦牙糖状，再加入后一液体，继续搅拌，使之均匀，然后保

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存在干燥器中备用，一般临用前配制。

3.树脂618：

树脂618 6ml

DDSA 4ml

DMP - 30 0.1ml

配法同前。

三、包埋方法

组织脱水后入中间溶剂或不入中间溶液，直接入纯丙酮与包埋剂混合液中开始浸透，过程是：

纯丙酮＋包埋剂（1:1） 1小时

纯丙酮＋包埋剂（1:3） 3-4小时

纯包埋剂（35℃） 过液

接着包埋于新换的包埋剂于预先干燥的胶囊中聚合：

包埋剂 (37℃) 24小时

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包埋剂 （45℃） 24小时

包埋剂 （60℃） 24小时

后二次包埋剂不必更换胶囊，只要改变温箱的温度既可。

第四节 超薄切片

超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。

超薄切片机比普通切片机精密的多。其控制切片的厚度是通过热膨胀装置推进样品臂运动使组织块向刀推进。切片使用玻璃刀，有专门的制刀机制刀。修组织块也有特制的修块机，可以修切成很工整的组织块。在很多情况下，需要先切一些面积较大的厚切片在光学显微镜下检查，然后考虑选取某些细胞或细胞某一部份作超薄切片。这样可以将组织块修切得越小越好，并使其上下平行，一般修成梯形或长方形，这样才能得到连续，平直的切片带。

超薄切片的厚度一般是通过观察刀槽液上切片的干涉色而估计的。

暗灰色 400埃以下

灰 色 400-500埃

银白色 500-700埃

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金黄色 700-900埃

紫 色 900埃以上

紫色的超薄切片，太厚无法观察。金黄色的切片分辨差。但当切片的厚度降低时，反差和可见性随之降低，因此太薄的切片也不理想。理想的切片应当很薄，而仍然有足够的反差，一般树脂包埋的超薄切片在500埃以下就相当理想了。真正银白色的切片其分辨率在25埃左右，这样的厚度的切片放在5万倍以下可以说对绝大多数生物医学工作都是十分理想的。

切出来的切片是漂浮在刀槽液上，需要收集到有支持膜的载网上，才能进一步的染色和观察。

载网是不锈钢丝制成的，上有网孔，高分辩率研究所需要的载网网孔要200目以上，而且以圆孔较好，载网上的支持膜有火棉胶膜，Formvar 膜、碳膜和塑料基底碳膜等。现在最常用的是Formvar 膜，用氯仿配制 0.2%—0.25%的Formvar 液。用洗净的载玻片制成膜，然后将洁净的载网，复盖膜上，从水中捞起晾干备用。

第五节 染色

一、染色原理

光学显微镜切片的染色，是利用组织和细胞内部各种不同成份与生物染料作用，使各结构呈现出不同的颜色，在光学显微镜下能够清楚的区分和识别。电子显微镜的染色则不能使用一般光学显微镜切片染色的生物染料，亦不能观察到不同的颜色，电子显微镜的染

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料，主要是重金属，例如铀和铅等。细胞内不同结构的区别主要是通过染色后所呈现出的电子密度大小来识别，也就是说电子显微镜切片的染色是为了增加超微结构的反差。实际上，在化学固定时也有染色的作用，例如固定液中含有四氧化锇或高锰酸钾，在固定的同时又起有染色作用。但是用戊二醛固定的标本，则没有染色作用。

染色液和固定液之间的可能反应会影响染色效果，所以在染色之前要先将固定液洗净。

超薄切片的染色为正染色又称阳性反差染色，是把生物标本的结构成份强化，即染色剂与微细结构成份结合，增加其散射电子的能力，最终在荧光屏上形成正像。还有一种染色为负染色又称阴性反差染色，它是借助于染色剂的衬托，增加背景对电子散射的作用，生物标本结构相对较多地通过电子，最终在荧光屏上形成暗背景下的亮像，这主要用于分散颗粒（病毒、大分子等）的染色。

作为电子染料的重金属，必须是当作离子或胶粒来使用，因为这都是一些带有电荷的小颗粒，它们和标本结合的可能原理之一是静电结合，也可能是以生成络合物或复合物的方式结合的。有人曾指出，至少在膜染色上，重金属负性染料的结合需要有亲水性基质的存在。根据这种见解，疏水性基质不能与磷钨酸(PTA)或醋酸钠那样高度带电的染料结合。这就意味着重金属染料的结合，可能不依赖于其所带的电荷是正或负，而依赖于基质的亲水性能。

染色的目的是为了增加反差。超薄切片的反差主要依赖于细胞不同部位的厚度和密度的差别。染色后的密度与作为染料的金属分子相结合的量有关，结合的金属分子越多，染色部位密度越大，而在一定的染色时间内，较厚的切片结合的金属分子就越多，所以较薄的切片染色时间可以适当长一些。

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各种不同类型组织的合适染色时间是不太容易预测的，因为决定染色时间的因素很多，例如，组织类别、固定液的成份、包埋剂类型、染液的组织、pH和浓度、染液的温度以及切片的厚度等。在一般情况下，染色时间尽可能短，染色时间过长会引起细胞内含物的被提取或者去染现象，也会产生金属在微结构上过多聚集而出现粗颗粒现象。例如，切片后用铅染色就容易发生这种情况，而铁粒子染色长于10分钟便开始消失发生去染现象。

作为理想的染液应该具有下列的优点：（１）染色均匀；（２）染色颗粒细，不使精细结构变形；（３）能提高适当的反差；（４）不产生人为的沉淀；（５）比较良好地保存细胞内的各种组分；（６）和固定液不发生不良反应；（７）在室温下稳定，能够保存较长的时间；（８）对细胞内精细结构的选择定位较强。

二、染色剂及染色方法

电子显微镜超薄切片的染料大多是无机试剂，特别是重金属，而且原子序数都较高。如锇原子序数76，铅、82，铀92。还有铟、钍、铋、钒等稀有金属。但是有机试剂对于超微结构的细胞化学染色也是常有的。为了使细胞各部位各成份，显示出不同的反差，一般切片要进行一次以上的染色。例如，经四氧化锇固定的组织，通常要用铅进行染色，还要用铀染色，这就是通常的“双染法”，已成为电镜超薄切片的常规染色法。下面仅就此进行介绍。

醋酸铀和硝酸铅这两种染色剂都能提高细胞结构成分的反差。但醋酸铀以提高核酸核蛋白的细胞结构以及结缔组织纤维的反差为主。硝酸铅主要与切片中还原锇起作用，使细胞膜系统及脂类反差更为显著，二种染料合用起到了互补的作用。

1.染液配制：

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（１）醋酸铀饱和酒精溶液（pH3.5）：

醋酸铀 2g

50%酒精 100ml

（２）柠檬酸铅染液（pH12）：

Ⅰ.硝酸铅 1.33g

柠檬酸钠 1.76g

蒸馏水 30ml

Ⅱ.1NNaOH 8ml

以上Ｉ液混合物置于50ml烧瓶内摇动约20分钟，至溶液呈乳白混浊，然后加8ml1NNaOH（Ⅱ），最后用蒸馏水稀释至50ml，反复摇动烧瓶使之混合，于2500-3000 rpm。离心15-20分钟，上清液即可使用。

2.染色方法

（１）用小培养皿做二个蜡盘或用蜡纸置于小培养皿内，在蜡盘上挖几个小坑，在边上贴上数码，以便染色时分别不同材料，避免弄混了。

（２）先染醋酸铀液，用吸管吸取染液数滴至培养皿内蜡盘的小坑里，用镊子取载网

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漂浮在染液上染色，切片面朝下，染色时间为 15-30分钟。

（３）染色后夹载网在四个盛有蒸馏水的烧杯中依次清洗去多余的铀染液，每杯至少洗20下以上。

（４）用滤纸将多余的水吸去晾干。

（５）在另一个蜡盘周围放置数粒氢氧化钠，盖紧片刻。

（６）用另一吸管吸取铅染液数滴在蜡盘小坑内，盖紧。

（７）打开盖，迅速用镊子取载网漂浮在染液上，盖紧。染色 15-30分钟。

（８）打开盖，迅速取出载网，同上法洗去多余染液，吸去多余水。

（９）置于干净容器中保存，干后即可上机观察。

三、负染

前面已述负染色是增加背景对电子散射的作用，生物标本最终在荧光屏上形成的是暗背景下的亮象。下面介绍病毒与细菌的负染方法：

1.负染液

使用浓度 pH

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磷钨酸液 1—5% 6.8—7.4

醋酸铀液 2% 4.8

甲酸铀液 1% 4.0-5.2

钼酸铵液 1—3% 6.8

2.病毒和噬菌体

（１）样品提纯至106-108 粒／ml

（２）滴一滴悬浮于有碳膜的载网上，停留数分钟。

（３）用吸管滴一滴染料在载网上，10-60秒钟之后用滤纸吸去染料（如果染料不均匀地在碳膜上散开，加甘油至颗粒悬浮液中）。

（４）空气干燥后，即可观察。

3.细菌

（１）提取样品的浓度至约1010颗粒／ml

（２）悬浮于2%磷钨酸或者其他任何一种负染色液使得细菌在混合液中的最终浓度在105—106ml之间。

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（３）用吸管滴一滴混合液至有碳膜的载网上。

（４）数秒钟后，用滤纸吸去混合液，空气干燥后，便可观察。

显微摄影术

显微摄影术是利用显微镜和照相装置把显微镜下观察到的物象如实地记录下来，供进一步分析研究的技术。与描绘方法相比，它具有快速、正确的优点。它已经成为生物学、医学科学领域中一项最基本的最常用的研究技术。

第一章 显微摄影装置及操作

显微摄影装置包括：显微镜、照明装置和照相装置三部分。

第一节 显微镜

一、显微镜的选择

显微镜的种类很多，用于显微摄影的显微镜必须具备以下条件：

1.选用镜台移动式调焦的显微镜，以防止曝光时焦距改变。

2.摄影目镜筒要能承受住照相装置的重量。

3.聚光镜带有孔径光阑和调节光轴中心的构造。

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4.要有可调节的视场光阑。

5.要有放置滤色片的装置。

6.要具有能调光的照明装置，物镜从低倍到高倍变化时，都能得到均匀明亮的光亮度。

二、物镜和目镜的选择与组合

显微摄影所用的物镜要求具有分辨率高，象的平面性好（能同时清晰地看到视野中心和视野四周象的焦点）的性能。目镜应以能够充分发挥物镜性能为好，即选用的目镜要能够配合物镜起补偿作用，使物镜的色差、象差得到补偿，使投射到感光底片上的图象四周与中心都尽可能在一个焦平面上，因此使用制造厂家指定的目镜，是十分重要的。

由于显微镜的分辨率取决于物镜的数值孔径（N·A），而显微镜的有效放大率为所用物镜数值孔径的 500-1000倍。例如使用N·A 为 0.65的40×物镜，其有效放大倍数为325-650倍，故应选用8-16倍的目镜。若使用16倍以上的目镜，所得到的放大倍数就是“无效放大”，对分辨物象细节，丝毫没有帮助。一般在有效放大率的范围内应采用高倍的物镜配合低倍的摄影目镜，就能得到最佳的物象分辨率。

另外，物镜和目镜组合是否适当，还影响到物象焦点深度和视野宽度。焦点深度是指物象的某一点被准焦时，其清晰部分的上下距离，即普通摄影中的影深。焦点的深度与物镜的数值孔径和总放大倍数成反比，数值孔径小，放大倍数低的物镜的目镜，其焦深长，反之焦深短。视野宽度也与总放大倍数成反比，放大倍数变大，视野宽度缩小；反之，视野扩大。

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三、光阑的作用

显微镜装有两种光阑：视场光阑及孔径光阑，它们的开启度可以调节。

视场光阑位于镜座之中，可以根据物镜的倍率给予不同直径的光束面积，在显微摄影时，起着增减物象反差的作用，视场光阑的适宜开启度，以其边缘外切孔径光阑为好。

孔径光阑安装在聚光镜上，它的作用是使物象的分辨率，反差及焦深达到最佳状况，要取得这些最佳效果，就要使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相匹配。一般在不过多地降低分辨率的前提下，把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的60-80%之间是比较合适的。例如，用N·A为0.25的10×物镜，如果使孔径光阑缩小到80%，聚光镜上的刻度标记应放在0.2的位置上。

当孔径光阑缩小，视野亮度降低时，可适当调高电压使照明强度得到补偿。

第二节 照相装置

显微摄影对照相装置的要求是一个能装底片的照相暗匣，附有卷片，定片装置，一般不需要镜头，通常有一个连接筒与显微镜相衔接，上面附有调焦目镜，以便对焦。下面介绍利用普通国产135照相机显微摄影装置和OLYMPUS-BHS系列显微镜的PM-10AD型照相装置的使用。

一、国产135照相机显微照相装置

1.一般带照相装置的高倍显微镜无论是直筒式或斜筒式的都可使用。照相前先在显微镜下找到目标，然后卸去镜筒，装上照相专用的连接筒，并在连接筒的上方放上照相目镜。

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2.国产135照相机如海鸥牌、孔雀牌均可使用，照相时装上胶卷，取下镜头，把机身通过特制套环，套在连接筒上，在照相机上配上快门线，即成显微摄影装置。

3.通过照相机的取景框，可看到所要拍摄的目标，但是此时的焦距已发生变化，必须对着取景框，重新调焦、对光，使物象达到最清晰状态，然后拍摄。

4.曝光是显微摄影的关键之一，原则上是低倍镜，曝光时间短，高倍镜约增高一倍，油镜又须为高倍镜的一倍。正确的曝光时间要通过试片来确定，即同时试拍 1、1、1／2、1／4、1／8、1／16等比例的片子，选择其中最好的作为经验。

5.每次曝光之前，都须重新调整焦点

二、OLYMPUS—BHS系列显微镜的PM—10AD型照相装置的使用

该机配用35mm照相盒，适合于135胶卷的拍摄，该装置由计算机自动处理各种信息，操作者要熟悉仪表度盘和旋钮的作用，将有关数据输入，由计算机计算，修正，即可获得最佳曝光。

1.安装

⑴安装35mm暗盒接合器和35mm暗盒；

⑵把转筒式调焦目镜装在自动曝光装置机体上；

⑶先将NFK摄影目镜装入目镜接合器中，再在目镜接合器上安装自动曝光装置机体，再将装置安装在显微镜的镜筒上。

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⑷连接电源软线，一端插入，自动曝光装置机体的背面插孔中，另一端和自动控制装置背面的插孔连接，输入电源线的压横插头连接到自动控制装置的背面插孔中，另一端与电源相接。

2.主要部件及旋钮的作用

⑴自动曝光装置机体

光程杆：分三档，分别涂黄、绿、白色环带

黄色档（VCT）：80%光线进入调焦目镜，20%入测温仪，该档用于调整光源色温。

绿色档（CVE）：64%光线进入胶底片，16%光线入调焦目镜，20%进入测光电池，该档适于一般明视野摄影。

调焦目镜：用于取景和调焦，取景调焦前先进行屈光度调节，使不同视力的操作者都能准确聚焦。调节时，转动屈光度调节环，使目镜取景器玻璃屏上的双十线最清晰为止，双十字线校准后，不要随意变动，再用显微镜的调焦螺旋使物象准焦。

⑵自动曝光调控装置

曝光方式选择刻度盘（MODE／EXPOSURE TIME）：

AUTO ─ 自动曝光档；FLASH ─ 闪光同步器；

MANUAL ─ 手控曝光；EXPOSURE ─ 曝光钮；

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ASA胶片感光刻度盘（ASA）：

国产胶卷为ASA100（GB21°）

安全灯（SAFETY）：

若灯显绿色，示可以进行正确曝光；若呈红灯，并伴有警告声响，示不能正确曝光；持续蜂鸣声，示照明光源照度不足；间歇蜂鸣声，示光源照度过强。此时，可以进行调整照明度，直至安全灯显示绿色为止。

倒易律失效补偿刻度盘（RECIPROCITY）:

通常将旋钮打在“4”位置上即可获得正确曝光。

曝光调节刻度盘（ EXPOSURE ADJ ）：

根据标本的分布状态和背景的明暗反差，通过刻度盘的调节，使曝光得以补偿，达到最佳曝光，一般旋钮对准 1的位置。

第三节 滤色片的使用

显微照明质量的优劣与影象的反差有密切的关系。如果所照的标本之间反差增强，则显示的结构就明晰，若反差不足，则结果就差。影象反差不足除了染色不好外，还可因为：标本在视野以外，被照明部分散射的光线太多，聚光器的光阑比物镜所能容许的为大，如欲校正这种缺点，可以缩小聚光器下的光阑，使反差增强，但这又降低了物镜的分辨力。所以一般利用滤色片对色光选择吸收原理，通过控制色光，增强或减少标本物象在底片的

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感应，以便获得最佳反差的底片。因此，滤光片是显微摄影不可缺少的附件。

一、滤色片的原理

普通光线经分光镜分析可显示出连续的色带，这种色带主要是由紫－蓝、绿和红三个主要部分组成。光的波长大致也分成三部分：紫－蓝，400-500纳米；绿，500-600纳米；红600-700纳米。在摄影中，通常把蓝、绿、红光称为三原色带。当三种原色光等量混合则形成白光。而把蓝光与黄光，绿光与品红，红光与青光称为三对互补色光，两种互补色光混合相加均可得白光。因此，黄、品红、青三色就分别为蓝、绿、红三原色的补色。

现在已知有色物体对光的吸收与颜色之间的关系，当物体呈现天蓝色时，即表示它吸收了深红色。紫－蓝物体吸收橙色。滤色片对各种色光具有选择吸收的特性。它仅让与其颜色相同的色光透过，而与其颜色互补的色光则被吸收了。被摄标本的物体反射出来的色光，通过滤色片的选择作用，在底片产生相应的密度，

当某种色光通过量多，底片感受力增加，在印放出来的照片上，该色光的色调变淡，显得的较明亮；当某种色光通过量少，底片感受力弱，在印放出来的照片上，其色调深，显得比较暗。

二、滤色片的选用

1.黑白摄影中滤色片的选用

已知滤色片的作用是使得其波长一致的光透过，限制波长邻近的色光，阻止与它互补的色光透过。因此选用滤色片是要根据研究的目的，如要使标本中某种颜色在照片上呈现

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得特别明亮（变淡）。就必须选用与该颜色相同的滤色片；反之，要使标本中某种颜色在照片上显得特别浓黑（提高反差），就必须选用与该颜色互补的滤色片。例如：染色体用H·E染色，呈蓝色，而细胞质呈红色。在摄影时，加上一个蓝色的补色 ── 黄色滤色片，这样染色体上反射的蓝光，通过黄色的滤色片，几乎全部被吸收，不再作用在底片上，染色体在底片上呈白色，其它部分为黑色，印放出来的照片，染色体部分是深黑色的，而细胞质背景呈现光亮的白色，黑白分明，物象清晰。相反，如果选用蓝色的滤色片，则染色体反射的蓝色，全部通过滤色片，使底片感光加强，染色体在底片上呈现更为浓黑，而印放出来的照片上染色体将变得浅明亮，与周围的细胞质背景混为一片，则照片反差降低物象模糊。

由此可见，选用不同的滤色片，可使同一物体出现完全不同的结果，所以在显微摄影中，正确选用滤色片是很重要的，在各种不同染色的标本中需要增加反差时，可参考使用下列滤色片。

⑴染成蓝色的标本使用红滤色片

⑵染成绿色的标本使用红滤色片

⑶染成红色的标本使用绿滤色片

⑷染成黄色的标本使用蓝滤色片

⑸染成棕色的标本使用蓝滤色片

⑹染成紫色的标本使用绿滤色片

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⑺染成蓝－紫色的标本使用黄滤色片

2.彩色摄影中滤色片的选用

在彩色摄影中，不仅要考虑光源强度，还要考虑“色温”问题。所谓“色温”，就是温度与光颜色的关系。例如，把一块黑色的铁块慢慢烧热，随着温度变化，铁块的颜色也发生变化；色温低时红色强，光也弱；色温高时，发蓝色，光也强。

在彩色摄影中，必须使光源的色温和彩色胶卷的色温一致，才能真实地再现物象的颜色。如果光源色温高于胶卷色温，彩色物象呈现偏青蓝的色调；若低于胶卷的色温，则呈现偏橙红的色调。因此，为了使彩色胶卷能与不同色温的光源相适应，就必须对光源的色温进行调整。其方法就是选用校正色温滤色片。在OLYMPUS的PM－IOAD型摄影装置中，选用LBT滤色片（琥珀色）配合灯光型的彩色胶卷，而选用 LBD—2滤色片（蓝色）配合日光型的彩色胶卷。

下面介绍色温的校准：

⑴先用装有标本的载玻片空白部分放在物镜下聚焦，以便测定光源的色温。

⑵把光程杆拉到黄色档的位置（ VCT ）。

⑶根据所用彩色胶卷的类型，把色温微型组件左侧转轮上的“D”（配用日光形彩卷）或“T”（配用灯光型彩卷），对准正面长方形字盘中间的三角形标光上。

⑷根据所用的彩卷，选用不同的校正色温滤色片，放在显微镜座的滤色片架上，使用灯光型彩卷，加用 LBT 滤色片；选用日光型彩卷，加用 LBD - 2 滤色片。

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⑸调节位于显微镜座右手侧的滑动电压控制杆，使照明光源的电压升降，直到色温测定器的示度盘上中央黄色三角形窗亮时，表示光源照明光线的色温与所用彩卷的色温平衡。如果是三角形窗上面的绿色方窗亮，表示光源的色温偏高，愈位于上方，色温愈高；如果三角形窗下面的红色方窗亮，表示光源的色温偏低，愈位于下方，色温愈低。

色温校准后，光源的电压，滤色片系统，不能再改变。如果光源照明太亮，只能加中灰滤色法（ N.D 滤色片 ），即可减少照明亮度，又不会改变色温。

⑹将光程杆推进一级，回到绿色档（ CVE ）的位置.

⑺将载波片上所要拍摄的样品部位，移入光路。

⑻按正常程序进行拍摄，其方法同黑白胶卷摄影技术。

第四节 感光材料

感光材料，指的是摄影用的底片及晒印或放大照片用的相纸。在这些材料的片基上涂有一层乳白色的，遇光能起化学反应的卤化银乳剂，因此称它为感光材料。

一、底片的种类

底片的种类很多。从底片片基的性质来分，可分为硬（干）片和软片（胶片）两大类。硬片是以玻璃为片基，它常用于大型照相机上。软片就是指以赛洛珞为片基的胶卷，适用于小型摄影场合。常用的胶卷有120、135胶卷。135胶卷因画面小，拍摄后需要进一步放大，适于显微摄影。从感光材料性能来分，又可分为以下几种：

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1.色盲片（亦称无色片）：

其乳剂中除卤化银外未加化学增感剂，仅能感受紫、蓝二色光，对黄、绿色光感受迟纯，对红、橙色光不能感受，故可在红灯下操作。为一种低速感光片，银粒细，反差大，适用于翻拍书籍、图表制作幻灯片等，但不适于一般照相。

2.分色片（亦称红灯片）：

其乳剂中加入黄绿增感色素。除感受蓝紫色外，对黄绿二色也能感受，但不能感受红橙色光。它不仅反差强，颗粒细，还能记录较多亮度等级和较宽的感色范围，除红橙标本外，适用于显微摄影。可在暗红灯下操作，这对初学冲底片的人较适合。

3.全色片：

其乳剂中添加完善的化学增感色素。感光范围从蓝紫光延伸到橙红色区域，即可感受可见光的各种颜色，故称全色片。可在极深的绿光下照一个很短的时间，因此又称“绿灯片”。该胶片银粒细，感光速度快，反差小，黑白等级多，适于各种摄影工作，尤其拍摄多色的物体，还可以用于夜间或灯光摄影。

4.彩色片：

为全色片和分色片等两、三种感光剂的复合组成的。含有青、品红和黄等三种不同颜色剂，经感光冲洗后，可显示各种色彩。彩色片主要有：

（１）彩色反转片

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该种胶片经过曝光，冲洗后，就成为和景物颜色相同的透明片，可直接供幻灯观赏或制版之用。

（２）彩色负片

其经曝光，冲洗加工后，得到与摄影物明暗相反的影象，其色彩则为被摄景物的补色，彩色底片用彩色相纸经过扩印或放大，即成彩色照片，或用彩色正片拷贝成彩色透明片。

（３）彩色正片

不能用于摄影，常用作彩色负片的拷贝，制作正片，如电影片以及幻灯片等的制片。

二、底片的感光速度

各种底片的感光物质对光的感受速度各不相同。感光速度主要取决于卤化银的性质，其中以溴化银的感光速度最快，氯化银次之，碘化银最慢。感光速度常用数字表示。数字愈大，表示感光速度愈快，愈灵敏；反之愈迟纯。对此各国有自己的标准，我国使用GB使用制，德国采用DIN制，美国使用ASA制，其中GB制等同于DIN制，如21°DIN（ASA100）的全色胶卷，多在显微摄影中采用。

胶卷的感光度直接影响到曝光时间。在DIN制中，每差三个数值，胶卷感光时间相差一倍，如21°DIN 胶卷，最佳的感光时间为1／15秒；若改为 24°DIN 胶卷，只要曝光1／30秒，若用18°DIN 胶卷则要用1／8秒。

三、相纸的种类

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相纸也为感光材料。根据乳剂中卤化银的不同可分为印相纸、放大纸和印放两用纸。

1.印相纸又称为氯化银感光纸，感光速度较慢，画面色调为淡黑色。

2.放大纸又称为溴化银感光纸。感光速度快，画面色调为冷黑色。

3.印放两用纸又称溴化银感光纸。感光速度依两者比例不同而有所差别，层次较丰富，色调和谐。

另根据纸面形状不同，又可分为：大光面、半光面、绸纹面、布纹面及粗细面等。

四、相纸性能及表示法

由于相纸乳剂中的成分不同，因此在感光速度、反差强弱及色调浓淡等方面均有差别。相纸反差性能常用软、硬来表示。它分为特软、软、中、硬和特硬五个等级，用数字1、2、3、4、5表示之。数字愈大，表示性能越硬，反差愈大，感光速度愈慢。

在放大照片时，要按底片反差情况选用适当的放大纸，以调节反差的强弱，使反差过强或过弱的底片得到适当的弥补而洗出较好的照片。反差正常的底片要配中性纸（2号），反差弱的底片要配硬性的（3或4号），反差强的底片要配软的相纸（1号）。

第七章 暗房技术

暗房技术是显微摄影一个重要组成部分。它包括底片的冲洗，照片的印放等项工作。一张照片的产生需要经过如下过程：

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拍摄（光作用）＋显影（化学作用）──负片，

印放（光作用）＋显影（化学作用）──正片。

第一节 显影

底片曝光后，得到的潜影经过显影剂的还原作用就得到黑色的银形象，这个过程称为显影。

一、显影液及其配方

显影剂是一种化学还原剂。其作用在于使已曝光的卤化银晶体还原为金属银，而对未感光部分的晶体，不起作用。显影剂配方有几种适合不同用途，可买现成配好的，也可以自行配制。

1.D-76普通微粒显影液配方（适于冲底片的负性显影液）：

米吐尔【硫酸甲基（对）氨基苯酚】 2g

无水亚硫酸钠 100g

对苯二酚 5g

硼砂 2g

温水（50—52℃） 750ml

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配制时将上述药品逐项充分溶解后，加蒸馏水至1000ml即可，在18°-20℃时，一般曝光正常的底片约13分钟左右。

2.D-72显影液（适用于印相、放大及冲幻灯片的正性显影液）：

米吐尔 3.1g

无水亚硫酸钠 45g

对苯二酚 12g

溴化钾 1.9g

温水（50 - 52℃） 600ml

配法同前述，使用时，在液温18-20℃下，用原液或冲淡一倍。晒印照片显影时间约1分钟，放大照片显影约2-3分钟，若用于冲洗底片或幻灯片，用原液显影约8分钟。

二、显影方法

底片显影的方法有：“罐中显影”、“盘中显影”，罐中显影是把底片装入胶带式或沟槽式的显影罐中进行显影。其优点是除装底片须在暗室中进行，其余操作均可在室外进行，底片自始至终浸没在显影液中，液温易调整，易获得微粒显影的效果。但每次使用药液量约500ml，也不能单独调整底片的显影时间。“盘中显影”，必须自始至终在暗室中进行。把少量药液倒入盘中，底片从暗盒中取出，用指夹住两边，先入清水中，数分钟使胶卷软化，然后药面向上，从任何一端先浸入显影液，接着渐渐向上提起，同时另一端渐渐下降。

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如此反复上下拉动，也可来回卷，使整个药面都接触到显影液，到达规定时间，取出水洗、定影。

第二节 定影

一、停影

底片显影后，应浸入1.5%醋酸水溶液中一分钟，使显影立即停止。因为显影液是碱性的，它和酸中和后，就失去显影能力，也可防止底片将碱性显影液带到酸性定影液中，从而提高定影液的使用期限。

常用的停影液配方：

蒸馏水 1000ml

28%醋酸 18ml

二、定影液及其配方

经显影、停影的底片（或照片）中，仅有15—30%卤化银晶体被还原，而余下来未被显影的卤化银可见光后，继续显影，因此需要用定影液把未还原的卤化银溶解掉，使底片（或照片）的影象得以固定。

F—5式定影液配方（适于一般底片、相纸）

温水（52℃） 600ml

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硫代硫酸钠 240g

无水硫酸钠 15g

28%醋酸 48ml

硼酸 7.5g

钾矾 15g

按顺序逐项溶解后，再加蒸馏水至1000毫升，定影时间为1020分钟，此液可反复使用，但若定影时间超过新鲜液一倍以上即不可再用。

三、水洗

经定影后的底片（或照片）上还残留许多硫代硫酸钠或银的络合物，必须经充分水洗，以避免底片（或照片）发黄或褪色。一般采用流水冲洗，底片应不少于15分钟，照片不少于20分钟，冲洗后，片置通风阴凉处晾干，切勿用手触摸药面损伤底片质量。

第三节 晒印及放大技术（示范）

（省略）

第二章 翻摄技术

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翻摄是摄影中复制原件的一种方法，它在教学和科研上应用很广，如日常中经常要把一些照片、图表、文献资料等制成复制品，供教学、学术报告，展览以及资料保存需要，这些都要应用到翻摄技术，下面简明介绍翻摄的基本知识与操作。

第一节 翻摄装置

一、照相机及附加镜

翻摄用照相机要求具有磨砂玻璃对光装置和长皮腔镜等条件，以利于测定焦点位置，辨别影像效果和直接翻摄近距离的物体以达到与原物同样大小影像，一般国产的135照相机；如海鸥牌照相机加用近摄镜或镜头接圈即可用于翻摄，这对于非专业翻摄工作来说使用亦较方便。

附加镜有偏光镜，各种滤色片和近摄圈。

1.偏光镜

偏光镜可消除被摄原件物体表面的反光。如翻摄影镜框中或压在玻璃板下的照片图表等，都会因为玻璃的反光，原件为其它杂乱的反光所掩盖或产生倒影，用偏光镜可把它们除去。如用偏光镜后曝光时间可增加2-4倍。

2.滤色片

翻拍文件或图表，经常遇到原稿上有污染的颜色，或原稿上有格子，或发黄。此外各种彩色图文资料要翻拍成黑白照片时，也要考虑原件上各种色彩应该用怎样的黑白色调来表现。如遇上述情况可在翻拍时加用滤色片进行调整，滤色片的使用类似于显微摄影。

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3.近摄圈

近摄圈具有使镜头的正度加大，焦距变短的作用。因此在原件大小超出相机镜头焦距范围的近距离翻摄中，可利用加近摄圈于原镜头上加以解决。常用的近摄圈有１、２、３号，号数越大焦距越短。若三个圈全加上则可照出与原件一样大的物象。使用近摄圈翻摄应增加曝光量的1／3，相机加用近摄圈后景深缩小，因此调焦必须十分准确。

二、翻摄的装置

有专门的翻摄机，上面装有机架和灯架，如135型立式翻摄机，也可自制简便的装置，只要有能上下调整的机架，配上照明光源即可。翻摄工作一般采用散射光源照明，而应避免在直射日光，或明丝灯泡下翻摄，因散射光照射在物体上比较柔和，阴影较淡，光线容易调配均匀。例如乳白灯泡，磨砂灯泡或散光式的强光灯就比较适用。翻摄物体两边的灯光强度要相同，并与物体距离相等，同时翻摄时光圈不宜过大，以便增加景深，减少中心部分与边缘部分距离差别的影响。曝光时间与灯光亮度、色光等都有关系，要靠经验摸索。

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