（完整版）细胞信号转导研究方法

细胞信号转导途径研究⽅法

⼀、蛋⽩质表达⽔平和细胞内定位研究

1、信号蛋⽩分⼦表达⽔平及分⼦量检测: Western blot analysis.

蛋⽩质印迹法是将蛋⽩质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋⽩质(抗原蛋⽩)，将PAGE胶上的蛋⽩条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进⾏，随后,将NC膜与抗⾎清⼀起孵育，使第⼀抗体与待检的抗原决定簇结合(特异⼤蛋⽩条带)，再与酶标的第⼆抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。基本流程：

检测⽰意图：

2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF）

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再⽤这种荧光抗体（或抗原）作为分⼦探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利⽤荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射⽽发出明亮的荧光（黄绿⾊或桔红⾊），可以看见荧光所在的细胞或组织，从⽽确定抗原或抗体的性质、定位，以及利⽤定量技术测定含量。

采⽤流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞⽔平检测不同细胞亚群中的蛋⽩质分⼦，⽤两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋⽩质分⼦的抗体，可在同⼀细胞内同时检测两种不同的分⼦（Double IF），也可⽤多参数流式细胞术对胞内多种分⼦进⾏检测。

⼆、蛋⽩质与蛋⽩质相互作⽤的研究技术

1、免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）

Co-IP是利⽤抗原蛋⽩质和抗体的特异性结合以及细菌蛋⽩质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋⽩的FC⽚段的现象⽽开发出来的⽅法。⽬前多⽤精制的protein A预先结合固化在agarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的⽬的。

当细胞在⾮变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋⽩质－蛋⽩质间的相互作⽤被保留了下来。如果⽤蛋⽩质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋⽩质Y也能沉淀下来。进⼀步进⾏Western Blot 和质谱分析。这种⽅法常⽤于测定两种⽬标蛋⽩质是否在体内结合，也可⽤于确定⼀种特定蛋⽩质的新的作⽤搭档。缺点：可能检测不到低亲和⼒和瞬间的蛋⽩质－蛋⽩质相互作⽤。

2、GST pull-down assay

GST pull-down assay是将⾕胱⽢肽巯基转移酶（GST）融合蛋⽩（标记蛋⽩或者饵蛋⽩，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋⽩(test protein或者prey被扑获蛋⽩)结合，然后根据⾕胱⽢肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋⽩的能⼒来确定相互作⽤的蛋⽩。⼀般在发现抗体⼲扰蛋⽩质－蛋⽩质之间的相互作⽤时，可以启⽤GST沉降技术。该⽅法只是⽤于确定体外的相互作⽤。⽰意图：

3、酵母双杂交系统

酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）的建⽴是基于对真核⽣物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因⼦的参与。反式转录激活因⼦，例如酵母转录因⼦ GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独⽴的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被

分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因⼦活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游启动⼦，使启动⼦下游基因得到转录。

将编码某⼀蛋⽩X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成⼀个杂交体(“诱饵”bait)，将编码另⼀蛋⽩Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另⼀个杂交体(“猎物”或靶蛋⽩prey or target protein)，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作⽤，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作⽤，则使BD和AD靠近形成⼀个有效的转录激活⼦，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋⽩质X和Y的相互作⽤。过程⽰意图：

4、荧光共振能量转移

荧光共振能量转移(FRET)是对⽣物⼤分⼦之间相互作⽤定性、定量检测的⼀种有效⽅法，是在活体细胞中实时地对⽣物⼤分⼦之间的相互作⽤进⾏动态监测.

两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、CFP等）的⼤分⼦在相互间距离⾜够近时会发⽣激发态能量⾮放射性地由⼀个荧光基团（供体）向另⼀个荧光基团（受体）转移的现象。如果发⽣FRET，则供体信号将淬灭

⽽受体信号将激活或增强. FRET 检测系统可以快速⾼效地捕获来⾃标定分⼦间相互作⽤的短暂微弱的荧光信号，⽽以分⼦尺度分辨出供体-受体的平均距离，并能显⽰出受体-供体的相互作⽤。过程⽰意图：

以光线激发后，供体荧光基因(ECFP–X)会将激发能量转移⾄距离10–100 ?以内的受体荧光基因(EGFP–Y)，进⽽使之发出荧光。研究⼈员即可通过检测受体荧光基因激发的荧光确认两蛋⽩质间的相互作⽤。ECFP：强化型蓝荧光蛋⽩质(enhancedcyan fluorescent protein)；EGFP：强化型绿荧光蛋⽩质(enhanced green fluorescent protein)。三、磷酸化蛋⽩质研究⽅法磷酸化蛋⽩质研究⽅法主要有：1、激酶活性的测定

信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因⽽对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC、

PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。其它还有：

2、Western blot with phospho-specific antibodies.3、Changes in mobility in SDS-PAGE

4、Phosphopeptide and phospho amino acid analysis by mass spectrophotometric analysis.

四、基因表达或转录活性检测

1、信号蛋⽩转录⽔平表达（mRNA）的检测:（1）RT- PCR / Realtime RT- PCR（2）Northern blot analysis.（3）RNase protection assay (RPA).

（4）“gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales2、基因启动⼦/增强⼦转录活性的检测:

（1）Transient or stable reporter assay—luciferase (Luc) or choramphenicolacetyl- transferase (CAT，氯霉素⼄酰转移酶基因)

（2）Nuclear run-on assay

五、蛋⽩质与DNA相互作⽤的研究技术

1、凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobilityshift assay）

是⼀种研究DNA结合蛋⽩和其相关的DNA结合序列相互作⽤的技术，可⽤于定性和定量分析。

2、染⾊质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）

真核⽣物的基因组DNA以染⾊质的形式存在。因此，研究蛋⽩质与DNA在染⾊质环境下的相互作⽤是阐明真核⽣物基因表达机制的基本途

径。CHIP是⽤于研究体内DNA与蛋⽩质相互作⽤的⽅法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋⽩质－DNA复合物，并将其随机切断为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段，然后通过免疫学⽅法沉淀此复合体，特异性地富集与⽬的蛋⽩结合的DNA⽚段，通过对⽬的⽚断的纯化与检测，从⽽获得蛋⽩质与DNA相互作⽤的信息。过程⽰意图：

六、信号转导中第⼆信使含量的测定第⼆信使含量的⾼低同信号传递密切相关。

1、[Ca2+]的测定：原⼦光谱法、离⼦微电极测定法、放射⽰踪法及标记⽰踪法等。⽬前常⽤标记⽰踪法，即⽤荧光探针标记靶细胞。常⽤的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等，后⼆者较为敏感。

2、IP3的测定：采⽤3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，⽤不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离⼦交换层析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进⾏液闪测定。此外，还可以使⽤Amersham公司⽣产的D-myo-IP3[3H]分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此⽅法简易、敏感。

3、DAG的测定：⾸先提取含DAG的样品，⽤DAG激酶催化底物DAG，使之发⽣磷酸化，外源加⼊32γ-ATP，最后将反应产物进⾏分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。

4、cAMP的测定：（1）cAMP[3H]分析系统，其优点是放射性半衰期长，可⽤于⼤量样品的分析；（2）cAMP[125I]分析系统，⽤于⼩量样品的分析；（3）cAMP ELISA测定⽅法，此⽅法简便、敏感。