细胞融合技术的发展及应用

2006年4月

激 光 生 物 学 报

ACTA LASER BIOLOGY SINICA

Vo.l15No.2

Apr.2006

#专题综述#

细胞融合技术的发展及应用

霍乃蕊,韩克光

a

b

*

(山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801)

摘 要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环

保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。

关键词:细胞融合技术;发展;应用中图分类号:Q813.2

文献标识码:A

文章编号:100727146(2006)0220209205

CellFusionTechnique:itsDevelopmentandApplications

HUONai2rui,HANKe2guang

a

b

(ShanxiAgriculturalUniversitya.CollegeofFoodScienceandEngineering;b.CollegeofAnimalScienceandTechnology,Taigu030801,Shanx,iChina)

Abstract:Cellularengineeringisoneofthefourtechniquesofbiotechnology,andasthecoreofcellularengineering,

thecellfusiontechniquehasacquiredoutstandingachievementsinmanyfieldssuchasagriculture,medicineandenvi2ronmentalprotection.Itsapplicationisstillincreasinginnumber.Theimprovementofthecellfusiontechniqueinvolvesthefusionagent,newmethodsandthecellsusedinfusion.Nownewcellfusionmethodsareresortingtothecombinedusageofphysicalandchemicalmethodstodevelopasimpleandconvenient,easyquantificationandatthesametimecanincreasethefusionrate.Alltheseaspectswerediscussedinthispapercenteredaroundthehistoryofthecellfusiontech2nique.

;applicationKeywords:cellfusiontechnique;development

细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。

细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合

*

收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222

基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094)

作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究.

(电子信箱)sxndkgh@163.com 210 激 光 生 物 学 报

技术的发展前景及其产生的影响将日益显著景做一简要回顾及展望。

[122]

第15卷

。比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物质PEG,作为病毒的替代物诱导细胞融合,这是一个里程碑式的发现,引起实验生物学的/无声革命0。但在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%~55%)对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG介导细胞融合法,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术等。总之,细胞融合技术在实践中不断发展和完善,细胞融合方法得到了不断的更新和改进,融合率也得到逐步的提高。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。

本文就其发展历史及研究进展,主要应用及发展前

1 细胞融合及其意义

1.1 细胞融合的概念

所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cellfusion)或细胞杂交(cellhybridization)。如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatichybridization)细胞,其特性会有很大的变化。

[1]

。体细胞融

合后可形成四倍体或多倍体细胞,由此形成的杂交

2.1 自然发生的细胞融合

早在19世纪,人们就发现在自然条件下生物界中有/自发0的细胞融合现象。Muller(1838年)在肿瘤中观察到了多核细胞,此后在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的扁桃体中陆续发现多核细胞

[3]

1.2 细胞融合的意义

细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞

的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。

细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义

[1]

,这些多

核细胞可能是病毒作用的结果,但当时还没有人认识到这一点。1875年Lange首先观察到脊椎动物(蛙类)血液细胞合并,继之又有一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合细胞。

2.2 组织培养中发生的细胞融合

自从Harrison(1907年)进行组织培养以后,人们便开始注意组织培养中多核细胞的形成。第一个报告组织培养中细胞合并的是Lambert(1912年)。到了1960年,法国Barski首先实现了异种动物体细胞的融合。但细胞在体外培养时,自发融合的频率是极低的。

,正得到科学界的日益重视。

2 细胞融合技术发展的历史回顾

人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合。随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备技术限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。然而,由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且2.3 病毒介导的癌细胞融合

195821960年日本学者冈田善雄(Okada)首先观察到流感病毒可杀死患欧利希癌的小白鼠腹腔中的腹水癌细胞(ETC),随后的研究中发现在取出的腹水中有无数巨大球形细胞。进一步在电镜下观察发现巨大细胞是呈车轮状排列的几个以至几十个核的多核细胞。这种多核细胞是由ETC融合形成的,并且发现这种巨大细胞形成的频率与接种病毒的量成一定比例。此后一系列的试验表明病毒能引起细胞融合的现象。此后,冈田善雄又发现流感病毒HVJ株在体外也可促进ETC的融合反应。添加病毒后发现ETC立即凝集,在37e下5min后细胞开始相互融合。他又对影响细胞融合现象的因子,如温度、氧气、钙离子、pH值等对细胞融合的影响进行了比较第2期 霍乃蕊等:细胞融合技术的发展及应用

211

深入的探讨,做了大量开创性工作,这些发现使得病毒类成为研究的最早的促融剂,并在此基础上开展了一系列的改进研究工作。

2.6 微生物细胞融合

1975年原生质体融合技术已扩展运用到微生物

中,匈牙利的Ferenczy首先报道PEG促使真菌融合,以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。

2.4 灭活病毒诱导的异种动物细胞融合

一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于

具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。同时Littlefield(1964年)又设计出有效筛选杂种细胞的一系列方法,从而进一步推动了融合细胞的实验工作。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。同年Watkins和Ko2prowski等又分别证明融合细胞能使缺陷型病毒复原。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作

[4]

2.7 PEG作为促融剂引起的革命

由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,科学家们又尝试寻找比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物PEG。加拿大华裔科学家高国楠等(1974年)的研究取得重大突破,他发现高分子量的聚乙二醇(PEG)在Ca

2+

存在时能促使植物原生质体融合,显著提高融合率,从而迅速推动了原生质体技术的基础研究和应用研究。至此,应用原生质体和发展操纵它们的方法,已引起实验生物学的/无声革命0。同时,Pontecorvo(1975年)发现PEG能诱导哺乳动物细胞融合并产生杂交细胞。1976年Davidson等对此作了进一步证实。以后的研究工作表明,PEG不仅可以促使植物、动物、微生物的细胞融合,而且还能促使动物细胞与植物的原生质体发生融合,促使微生物原生质体与动物细胞融合,使植物原生质体摄入微生物。1975年Ahkono报道用PEG将母鸡的红血球细胞和酵母菌的原生质体融合成功。1976年Dudus等报道人的细胞能和胡萝卜的原生质体发生融合。Davey(1972年)和Vasil(1977年)用植物原生质体摄取了细菌细胞

[425]

。

从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。

。

1975年,在动物体细胞杂交技术的基础上又创立了淋巴细胞杂交瘤技术。同体细胞融合一样,杂交瘤工作早期使用的促融剂)))灭活的仙台病毒,已逐渐为化学促融剂PEG所取代。Davidson等于1976年建立的以PEG诱发哺乳类细胞融合的方法,也同样适用于淋巴细胞同瘤细胞的融合。由于淋巴细胞杂交瘤技术能制备纯度高、专一性强的抗体,适于由未纯化的抗原大量制备,因而在短短几年时间里,即已被广泛用于制备各种单克隆抗体。

2.5 植物细胞融合

植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi2chel用0.5mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到1960年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。

20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。2.8 细胞拆合工程的诞生

20世纪70年代初,细胞融合技术进入了一个崭新的阶段,诞生了细胞拆合工程。Carter于1967年发现细胞松弛素B(cytochalasinB,简称CB)能诱发体外培养的小鼠L细胞的排核作用。Prescott等于1972年首先应用离心术结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功,为研究哺乳类细胞的核、质相互关 212 激 光 生 物 学 报

系、细胞质基因的转移开创了新的途径。由细胞核、质分离与细胞融合这两项技术汇合起来而建立的细胞重组技术,可使胞质体与完整细胞融合,构成胞质杂种细胞;胞质体与核体融合,构成重组细胞;把微核化细胞导入完整细胞,构成微细胞异核体。1982年,Ferenczy在真菌中应用这些技术,使核与原生质体的融合取得成功。这项技术对于研究核与核、核与胞质之间的相互作用及微生物代谢产物的调控过程有重大意义,也已成为育种工作的一条新途径

[1,4,6]

第15卷

菌,无毒性。但它只能逐一处理细胞,不能像其他方法一样同时处理大量细胞。细胞间相互接触是实现细胞融合的前提,目前,最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触,即光镊(poticaltweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间,在光斑直径与光波波长尺度相比拟时,指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力,该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处,从而实现对细胞的操作

[10]

。。

2.9 新的细胞融合方法

细胞融合技术在生物科学各领域取得进展的同时,从事细胞融合研究的科学工作者一直没有放弃寻找具有更高融合效率的方法。虽然用PEG作介质诱导细胞融合具有上述优点,但PEG诱导细胞融合也存在一些内在的问题,如PEG在有效的浓度范围内(50%~55%)对细胞毒性很大,因此人们又试图寻找新的方法来替代PEG介导细胞融合法。2.9.1 电脉冲诱导细胞融合技术 20世纪80年代产生了一种新的方法即电脉冲诱导细胞融合技术。德国的Halfman和Zmimermann等(1982年、1983年)发明的电融合法,以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为基础,对哺乳动物细胞、植物和酵母原生质体的融合都有成功的结果。电融合技术的优点在于:融合频率高,是PEG的100倍;操作简便,快速;对细胞无毒;可在镜下观察融合过程。目前,电融合技术已成为细胞融合的有效手段之一

[728]

2.9.3 空间细胞融合技术 植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在,有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大,异源细胞融合得率十分有限

[11212]

。在利用动物细胞融合生产单克隆

抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。20世纪80年代以来,德国细胞电融合技术发明家Zmimermann等人在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明,在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。融合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故,杂种细胞活力增加可能是细胞排列时间缩短引起的。在取得这些成功实验的基础上,进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经开始。

2.9.4 离子束细胞融合技术 雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体,20世纪80年代中期,中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。在离子束与生物体相互作用中,粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀,引起细胞膜透性和跨膜电场的改变,据此原理,发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外,离子种类、电荷、质量皆可调,因此,离子束的可操纵性高,可以用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。此项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量,将是细胞融合研究的一大进步

[13215]

。

2.9.2 激光融合技术 20世纪80年代中期又发明了激光融合器,迅速崛起的激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动),可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞

[1,3,4]

。1987年和1989

年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产物观测,发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活

[9]

。

激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无。

2.9.5 非对称细胞融合技术 即利用某种外界因素(常为C射线,即C融合,gamma2fusion)辐照某一第2期 霍乃蕊等:细胞融合技术的发展及应用

213

细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核。并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体,选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这两个原生质体品系的细胞,从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合,或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内,实现有限基因的转移,从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状

[1,9]

[2] 罗立新.细胞融合技术与应用[M].北京:化学工业出版社,

2003:1212.

LUOLi2xin.CellFusionTechniqueandApplication[M].Bei2jing:ChemicalIndustryPress,2003:1212.[3]

JENABP.

InsightsonMembraneFusion[J].CellBiologyIn2

ternationa,l2000,24(11):7692771.

[4] 罗立新,潘力,郑穗平.细胞工程[M].广州:华南理工大学

出版社,2003:5219.

LUOLi2xin,PanL,iZHENGSui2ping.CellEngineering[M].Guan2gzhou:SouthChinaUniversityofTechnologyPress,2003:5219.

[5] JOINERMC,BARRYDM,OLEGVB,eta.lGrayLaborato2

ryResearchAnnualReport[M].CellandMolecularBiophysics,1998:34240.

[6] GROSOVSKYAJ.Radiation2induceMutationsinUnirradiated

DNA[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:534625347.[7] HAYASHIT,TANAKAH,TANAKAJ,eta.lImmunogenicity

andTherapeuticEfficacyofDendritic2TumorHybridCellsGener2atedbyElectrofusion[J].ClinicalImmunology,2002,104(1):14220.

[8] RAMOSC,BONENFANTD,TEISSIEJ,eta.lCellHybridiza2

tionbyElectrofusiononFilters[J].AnalyticalBiochemistry.2002,302(2):2132219.

[9] QIPEIMIN,TODOROVAN,TODOROVAT,

eta.lAction

PotentialsPassSeveredEarthwormMGASegmentsReconnectedbyLaserandElectricFieldPulses[J].BrainResearchBulletin,1995,37(2):1892192.

[10] STEUBINGRW,CHENGS,NUMAJIRIY,eta.lLaserIn2

ducedCellFusioninCombinationWithOpticalTweezers[J].TheLaserCellFusionTrapCytometry,1991,12:5052510.

[11] ZIMMERMANNU,HANNIGK,etal.BiotechnologyinSpace:

PotentialsandPerspectives[J].6392672.

[12] JONGKINDJF,VISSERP,VERKERKA,eta.lCellFusion

inSpace:PlasmaMembraneFusioninHumanFibroblastsdur2ingShortTermMicrogravity[J].AdvanceinSpaceResearch,1996,17(6~7):21225.

[13] SCHETTINOG.LowDoseHypersensitivityinChineseHamster

V79CellsTargetedwithCountedProtonsusingaCharged2parti2cleMicrobeam[J].RadiationResearch,2001,156(5Pt1):5262534.

[14] LIUFeng,WANGYu2gang,XUEJian2ming,eta.lTransmis2

sionMeasurementBasedonSTMObservationtoDetectthePen2etrationDepthofLow2energyHeavyIonsinBotanicSamples[J].RadiationMeasurements,2003,37(1):9214.

[15] 袁成凌,余增亮.低能离子束在生物技术中的应用研究

[J].中国生物工程杂志,2003,23(4):57261.

YUANCheng2ling,YUZeng2liang.TheGrandProgressofLowEnergyIonBeaminLifeSciences[J].ChinaBiotechnology,2003,23(4):57261.

[16] HEITK,WULJ,LIUSX,eta.lMutagenicEffectsofaSin2

gleandanExactNumberofAlphaParticlesinMammalianCells[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94:376523770.Biotechnology,

1988,6b:

。

实践表明非对称细胞融合技术通过C射线和X射线等照射,为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性

[16]

。值得注意的是,

此方法特别适用于细胞质雄性不育基因的转移,通过辐照胞质不育的原生质体,破坏其染色体,与其具有优良性状品种的原生质体融合,从而获得实用的新的胞质不育系。这些都是常规育种所做不到的。

纵观细胞融合技术的发展历史,细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒,灭活病毒生物阶段到PEG化学物质阶段;新方法不断涌现,从生物学,化学方法,物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物,植物到微生物,从种内扩展到种间,从近缘扩展到远缘。每一次技术上的更新和改进都会带来应用上的巨大革命和创新,达到为人类服务的目的。

3 细胞融合技术的应用及发展前景

从细胞融合技术发展的历程可以看到,伴随着细胞融合技术的每一次革新和改进,都会迅速在各个领域得到充分的应用,然后在实际应用中又不断发现新的问题,在解决实际问题中又促使细胞融合技术跃上一个又一个新的台阶,使其日臻完善。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及三者之间的细胞融合不断应用于基础理论研究和人类生产实际。如创造新物种、培育动物新品种、植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖、获得优良的微生物菌种以及药物单克隆抗体和疫苗等有用物质的生产。并且细胞融合技术和基因工程的汇合,使生物工程进入了崭新的发展阶段。

References

[1] 李志勇.细胞工程[M].北京:科学出版社,2003:3221.

LIZhi2yong.CellularEngineering[M].Beijing:SciencePress,2003:3221.