MOG诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立及CD4 +CD25 +调节性T细胞检测

・１０４・　虫垦　墅鱼　学和神缝病学杂志２００９年３月第１６卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｎｅｕｒｏｌ　２００９，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２　ＭＯＧ诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型　的建立及ＣＤ４＋ＣＤ２５＋调节性Ｔ细胞检测　李　佳　，翁益云。，张　旭　（温州医学院附属第一医院神经内科，浙江温州３２５０００）　摘要：目的　探讨采用分子克隆技术合成ＭＯＧＩｇｄ＿ＴｒｘＡ融合蛋白免疫Ｃ５７ＢＩ　／６小鼠并建立多发性硬化（ＭＳ）　动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（ＥＡＥ）的可行性；通过检测ＥＡＥ小鼠脾脏中ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞　数量初步探讨ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞在ＥＡＥ发病机制中的作用。方法　（１）分子克隆技术合成ＭＯＧ　ＴｒｘＡ融合蛋白，纯化、超滤浓缩后用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白浓度。（２）Ｃ５７ＢＩ　／６小鼠分为ＭＯＧＩｇ　ＴｒｘＡ组（ＭＯＧ　组）、豚鼠脊髓匀浆组（ＧＰＳＣＨ组）、硫氧还蛋白组（ＴｒｘＡ组）及正常对照组（ＮＣ组）４组，１２只／组，各组以相应　抗原乳剂免疫小鼠制作ＥＡＥ模型后评估其临床神经功能、组织病理学改变（ＨＥ染色和髓鞘Ｌｕｘｏｌ　ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ染　色）并评价模型质量。（３）流式细胞仪（ＦＡＣＳ）检测小鼠脾脏中ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞百分比。结果　（１）纯　化浓缩后Ｍ０Ｇｌｇｄ＿ＴｒｘＡ蛋白纯度达９８　左右，浓度约２．３　ｍｇ／ｍＬ。（２）ＭＯＧ组小鼠与ＧＰＳＣＨ组小鼠在临床　神经功能评分等方面差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。两组发病动物组织切片ＨＥ染色和髓鞘染色均有不同程度　病理改变。（３）ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞占ＣＤ４　Ｔ细胞比例Ｍ０Ｇ组为（４．７１±１．６１）％，ＧＰＳＣＨ组为（１．４４　±０．６５）　，均明显低于正常对照组［（９．２２±１．２４）　］和ＴｒｘＡ组［（８．９７±１．２０）Ｖ００］（Ｐ＜０．０１）。结论　（１）分　子克隆技术合成的ＭＯＧ　蛋白免疫Ｃ５７ＢＩ　／６小鼠能够成功诱导出ＥＡＥ模型，且模型稳定、发病率高，这为进　一步研究ＭＳ免疫发病机制并采取有效治疗措施提供了一定依据。（２）ＣＤ４。。ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞数量与ＥＡＥ　小鼠临床表现呈相关关系。　关键词：实验性自身免疫性脑脊髓炎；ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞；多发性硬化　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—２９６３．２００９．０２．００８　中图分类号：Ｒ７４４．５１；Ｒ３３２　文献标识码：Ａ文章编号：１００６—２９６３（２００９）０２—０１０４—０５　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　Ｍｏｄｅｌｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＭｏＧ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｏｄｅｌｓ　ＬＩ　Ｊｉａ　，ＷＥＮＧ　Ｙｉ—ｙｕｎ。，ＺＨＡＮＧ　ＸＵ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｗｅｎｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｗｅｎｚｈｏｕ　Ｚｈｅｉｉａｎｇ　３２５０００，Ｃｈｉｎａ）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　（ＥＡＥ）ｍｏｄｅｌｓ　ｉｎ　Ｃ５７ＢＬ／６　ｍｉｃｅ　ｂｙ　ＭＯＧ　ｇｄ—ＴｒｘＡ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ａｕｔｈｏｒｓ＂ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔＯ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ＥＡＥ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１）Ｔｈｅ　Ｍ０ＧＩｇｄ＿ＴｒｘＡ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ．（２）Ａｎｉｍａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：Ｃ５７ＢＩ　／６　ｍｉｃｅ，１２　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ＭＯＧ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＯＧＩｇｄ＿ＴｒｘＡ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｉｏｎ．Ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＧＰＳＣＨ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ　ｏｆ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ（ＧＰＳＣＨ）ａｎｄ　ｍｉｃｅ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｖｏｌｕｍｅ　ｅｍｕｌｓｉｏｍ　ｏｆ　ＴｒｘＡ　ａｎｄ　ｓａｌｉｎｅ／ａｄｊｕｖａｎｔ　收稿日期：２００８—０９—２４；修订日期：２００９—０１—１３　作者简介：李佳（１９８３一），女，河南省人，在读硕士。　张旭（１９６３一），男，浙江省人，主任医师（教授），硕士生导师，主要从事神经内科Ｉ临床和神经免疫学研究。通信地址：温州医　学院附属第一医院神经内科，温州３２５０００。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｕ＠ｇｍａｉｌ．ＷＺ．ｚｊ．ｃｎ。（通讯作者）　中国神经免疫学和神经病学杂志２００９年３月第１６卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｎｅｕｒｏｌ　２００９，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＴｒｘＡ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ　ＮＣ）ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｓｃｏｒｅｓ　ａｎｄ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏ１ｏｇｙ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｔｏ　ｖａｌｕｅ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌｓ　ｑｕａｌｉｔｙ．（３）Ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ＥＡＥ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　（１）Ｔｈｅ　ＭＯＧ￣ｇａ＿ＴｒｘＡ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｕｒｉｔｙ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　９８　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　２．３　ｍｇ／ｍＬ．（２）Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｍ０Ｇ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　ＧＰＳＣＨ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｓｃｏｒｅｓ（Ｐ＞０．０５）．　Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ　ａｎｄ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｔａｋｅｎ　ｆｒｏｍ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ａｎｉｍａｌｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ｇｒｏｕｐｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ）．（３）Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＭＯＧ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　ＧＰＳＣＨ　ｗｅｒｅ（４．７１±１．６１）　ａｎｄ（１．４４±０．６５）　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｏｔｈ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＮＣ［（９．２２±１＿２４）　］ａｎｄ　ＴｒｘＡ　ｇｒｏｕｐ［（８．９７±１．２０）　］（Ｐ＜０．０１）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ（１）Ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ＥＡＥ　ｉｎ　Ｃ５７ＢＩ　／６　ｍｉｃｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＭＯＯ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ｏｕｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｗａｓ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ．Ｔｈｕｓ，ａ　ｇｏｏｄ　ｗａｙ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ＭＳ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ａｎｄ　ｔｏ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ａｓ　ｗｅｌ１．（２）Ｔｈｅ　ｐｅｒｃｇｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２　５＋Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ＥＡＥ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ（ＥＡＥ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ（Ｔｒｅｇ）；　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（ＭＳ）　多发性硬化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）是中枢神　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳全套装　经系统（ＣＮＳ）慢性炎症性脱髓鞘性疾病，其确切　置（ＢＩＯ　ＲＡＤ），微量组织匀浆器（广州市华粤行仪　发病机制尚不清楚　］。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白　器有限公司），超滤管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），层析柱（Ｍｅｒｋ，　（ＭＯＧ）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（ＥＡＥ）　Ｎｏｖａｇｅｎ），Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（ＥＬＸＳ００）　是ＭＳ经典动物模型ｌ＿２　］。目前所使用的ＭＯＧ多　（ＢＩＯ—ＴＥＫ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ．　Ｉｎｃ，Ｕ．Ｓ．Ａ），　为商业合成肽段ＭＯＧ３５—５５，尚未见以分子克隆技　ＦＡＣＳ—Ｃａｌｉｂｕｒ流式细胞仪（ＢＤ公司，Ｕ．Ｓ．Ａ）。　术合成的ＭＯＧ细胞外Ｉｇ样结构域（ＭＯＧｋ　）融合　１．２方法　蛋白诱导ＥＡＥ模型的报道。此研究探讨采用分　１．２．１合成ＭＯＧＩｇｄ　ＴｒｘＡ融合蛋白：重组表达质　子克隆技术合成Ｍ（）Ｇｌｇａ－ＴｒｘＡ融合蛋白免疫动物　粒ｐＥＴ３２ａ　ＭｏＧ　及ｐＥＴ一３２ａ（＋）在大肠杆菌　制作ＥＡＥ模型的可行性；在成功建立小鼠ＥＡＥ　ＢＬ２１一ＴｒｘＢ－中经诱导剂ＩＰＴＧ诱导扩大表达５　ｈ　模型基础上，检测ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞数　后所得含蛋白菌体沉淀，经渗透休克、包涵体分离　量，探讨其在ＥＡＥ发病机制中的作用，以便为进　以及ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳证实等步骤获得粗制　一步揭示ＥＡＥ发病机制提供依据。　ＭＯＧ　－ＴｒｘＡ融合蛋白。　ｌ材料和方法　１．２．２　ＭＯＯＩｇｄ＿ＴｒｘＡ融合蛋白纯化和浓缩：采用　金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白，然后通过超滤　１．１　材料　法浓缩目的蛋白，最后用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白浓　１．１．１实验动物：体质量１８～２０　ｇ、８～１Ｏ周龄雌　度。纯化和超滤后的蛋白液均经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ蛋白　性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任　电泳证实是否含目的蛋白条带。　公司）；体质量１８０～２００　ｇ白色豚鼠（温州医学院　１．２．３抗原制备：将通过上述方法所得ＭＯＧ　实验动物中心），雌雄不拘。　ＴｒｘＡ蛋白溶液、硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）溶液以及同　１．１．２　主要试剂和仪器：胰蛋白胨，酵母抽提物，　时制备的豚鼠脊髓匀浆（ＧＰＳＣＨ）和生理盐水分别　异丙硫代钠一Ｊ３半乳糖（ＩＰＴＧ），溶菌酶，ＤＮａｓｅ　Ｉ，　与完全福氏佐剂（ＣＦＡ）（含４　ｍｇ／ｍＬ　Ｈ３７Ｒｖ）等　Ｎｉ—ＮＴＡ　Ｈｉｓ　Ｂｉｎｄ　Ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｋ，Ｎｏｖａｇｅｎ），羊毛　体积混合，反复抽打制成油包水型乳剂。　脂、液体石蜡、结核杆菌（Ｈ３７Ｒｖ），百日咳毒素　１．２．４　模型制作：将Ｃ５７ＢＬ／６小鼠随机分为　（ＰＴ，Ｓｉｇｍａ），ＦＩＴＣ　ａｎｔｉ—ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４，Ｒａｔ　ＭＯＧｉｇｄ＿ＴｒｘＡ免疫组（ＭＯＧ组）、ＧＰＳＣＨ组（作　ＩｇＧ２ａ￣ＦＩＴＣ，ＰＥ　ａｎｔｉ—ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２５，Ｒａｔ　ＩｇＧ　为阳性对照）、ＴｒｘＡ组及正常对照组（ＮＣ组）４　２ｂｔｃＰＥ、红细胞裂解液（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎ—　组，１２只／组。以９００　ｆｚｇ　ＭＯＧＩｇｄ＿ＴｒｘＡ蛋白（约合　ｇｅｎ）；培养细菌用摇床［ＯＲＢＩＴＡＬ　ＳＨＡＫＥＲ　ＭＯＧ　多肽３００　ｂｉｇ）与等体积ＣＦＡ制成抗原乳剂　（Ｆｏｒｍａ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕ．Ｓ．Ａ）］，低温高速离心机　免疫ＭＯＧ组小鼠，双侧侧腹壁分４点皮下注射；　中国神经免疫学和神经病学杂志２００９年３月第１６卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｎｅｕｒｏｌ　２００９，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２　图２正常血管　一　Ａ：Ｌｕｘｏｌ　ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ染色×４Ｏ倍；Ｂ：Ｌｕｘｏｌ　ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ染色×４００倍　Ａ：Ｌｕｘｏ［ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ×４０；Ｂ：Ｌｕｘｏｌ　ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ×４００　Ｆｉｇ　２　Ｎｏｒｍａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｖｅｓｓｅｌ（ＨＥ×４００）　图３　ＧＰＳＣＨ组血管外炎症细胞浸润　Ｆｉｇ　３　Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｕｆｆｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　ＧＰＳＣＨ　ｇｒｏｕｐ（ＨＥ×４０）　图４　ＭＯＧ组侧脑室旁脱髓鞘　Ｆｉｇ　４　Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ　ｎｅａｒ　ｔｈｅ　ｌａｔｅｒａｌ　ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＯＧ　ｇｒｏｕｐ　是目前制作ＥＡＥ模型的最佳诱导物，但因其肽段　合成技术要求高、价格昂贵而受限制。为进一步研　究ＭＳ发病机制及后续治疗等问题，许多实验室尝　试采用生物工程技术合成ＭＯＧ蛋白。此实验正　是运用分子克隆技术成功合成了ＭＯＧＩｇｄ＿ＴｒｘＡ融　总之，此实验以分子克隆技术合成的ＭＯＧ　ＴｒｘＡ融合蛋白能够成功诱导稳定性好、发病率　高、抗原价格实惠、动物来源方便的ＥＡＥ模型建　立，并在此基础上通过流式细胞技术对ＣＤ４’。　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞表型进行了分析，初步探讨　了ＥＡＥ模型细胞免疫调节机制，这有益于进一步　揭示ＭＳ免疫发病机制以及ＭＳ的临床防治。　参考文献：　合蛋白后并经金属螯合亲和层析法进行了纯化，其　纯度达９８　左右。　此实验室以分子克隆技术合成的ＭＯＧ　ＴｒｘＡ融合蛋白诱导的ＥＡＥ模型小鼠病程呈慢性　非缓解型，病灶多发，主要分布于大脑白质，小脑、　［１］Ｐｒｙｃｅ　Ｇ，Ｂａｋｅｒ　Ｄ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃａｎｎａｂｉ—　ｎｏｉｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ｉｎ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　脑干也均有不同程度受累，并有ＣＮＳ炎性细胞浸　润、胶质结节形成、髓鞘脱失等ＭＳ典型病理改变。　而ＴｒｘＡ组小鼠在临床神经功能评分及病理检查　评分等方面均无发病证据，提示单体蛋白ＴｒｘＡ无　免疫原性，该结果从侧面进一步证明此实验室合成　的ＭＯＧ　可能成功诱导ＥＡＥ模型建立。　ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞是一类具免疫调　节功能的Ｔ细胞亚群，对维持外周免疫耐受、肿瘤　免疫监测及诱导移植耐受等具重要作用。研究表　明ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞可通过细胞一细胞直　［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００５，２８（５）：２７２—２７６．　［２］Ｓｔｅｉｎｍａｎ　Ｌ＿Ｏｐｔｉｃ　ｎｅｕｒｉｔｉｓ，ａ　ｎｅｗ　ｖａｒｉａｎｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉ　ｍｅｎｔａｌ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ａ　ｄｕｒａｂｌｅ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ａｌｌ　ｓｅａ—　ｓｏｎｓ，ｎｏｗ　ｉｎ　ｉｔｓ　ｓｅｖｅｎｔｉｅｔｈ　ｙｅａｒ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ，　２００３，１９７（９）：１０６５—１０７１．　［３］Ｊｏｈｎｓ　ＴＧ，Ｋｅｒｌｅｒｏ　ＲＮ，Ｍｅｎｏｎ　ＫＫ，ｅｔ　ａ１．Ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａ　ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ＥＪ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｌ９９５，１５４（１Ｏ）：５５３６—５５４１．　［４］Ｓｔｅｆｆｅｒｌ　Ａ，Ｂｒｅｈｍ　Ｕ，Ｓｔｏｒｃｈ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏ—　ｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍ　ｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ”ｒｅｓｉｓｔａｎｔ”Ｂｒｏｗｎ　Ｎｏｒ—　ｗａｙ　ｒａｔ：ｄｉｓｅａｓｅ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＭＨＣ　接接触、分泌抑制性细胞因子和空间竞争机制等发　挥免疫抑制作用。此外亦有研究结果提示，ＥＡＥ　动物体内的ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ细胞数量减少　或者其抑制功能下降　。　。此实验用ＦＩＴＣ—ａｎｔｉ—　ＣＤ４　Ａｂ、ＰＥ—ａｎｔｉ—ＣＤ２５　Ａｂ标记，经ＦＡＣＳ检测了　小鼠脾脏单个核细胞中ＣＤ４　ＣＤ２５。。调节性Ｔ细　胞比例，结果表明ＭＯＧ组ＣＤ４　ＣＤ２５　调节性Ｔ　细胞比例高于ＧＰＳＣＨ组，且ＭＯＧ组和ＧＰＳＣＨ　组均低于ＴｒｘＡ组和正常对照组，与国外研究结果　ａｎｄ　ＭＨＣ　ｌｉｎｋｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｂ　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，１６３（１）：４０～４９．　［５］Ｋｏｎｏ　ＤＨ，Ｕｒｂａｎ　ＪＬ，Ｈｏｒｖａｔｈ　ＳＪ，ｅｔ　ａ１．Ｔｗｏ　ｍｉｎｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｅｘｐｅｒｉ—　ｍｅｎｔａｌ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｉｎ　ＳＪＬ／Ｊ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ　ＥｘｐＭｅｄ，１９８８，１６８（１）：２１３－２２７．　ｒ　６］Ｋｅｒｌｅｒｏ　ｄｅ　Ｒｏｓｂｏ　Ｎ，Ｍｅｎｄｅｌ　Ｉ，Ｂｅｎ　Ｎｕｎ　Ａ．Ｃｈｒｏｎｉｃ　ｒｅｌａｐｓｉｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｏｎｓｅｔ　ａｎｄ　ａｌｌ　ａｔｙｐｉｃａｌ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｏｕｒｓｅ，　相符。此结果进一步证实由此实验室合成的　ＭＯＧＩｇｄ＿ＴｒｘＡ融合蛋白诱导ＥＡＥ的可行性。　・１０８・　中国神经免疫学和神经病学杂志２００９年３月第１６卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｎｅｕｒｏｌ　２００９，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ＰＬ／Ｊ　ｍｉｃｅ　ｂｙ　ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｊｇ０ｄｅｎｄｒ０ｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏ—　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＯＧ）一ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍ—　ｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ—ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＭＯＧ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，２５　（４）：９８５—９９３　ｐｌｕｓ　ＴＲＡＩＬ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７８（２）：９１８—９２５．　［１Ｏ］Ｃｈｅｎ　ｘ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ　ＪＪ，Ｗｉｎｋｌｅｒ－Ｐｉｃｋｅｔｔ　ＲＴ，ｅｔ　ａ１．　Ｇ１ｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｓ　ＩＬ－２一ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　［７］ＭｃＧｅａｃｈｙ　ＭＪ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ　ＬＡ，Ａｎｄｅｒｔｏｎ　ｓＭ．Ｎａｔｕｒａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏ—　ｍｙｅｌｉｔｉｓ：ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ４＋ＣＤ２　５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ＦｏｘＰ３（＋）ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｈｅｉｒ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｔｏ　ｓｕｐｐｒｅｓｓ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕ—　ｎｏ１，２００５，１７５（５）：３０２５　３０３２．　ＥＡＥＥＪ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６，３６（８）：２１３９—２１４９．　［１１１　Ｃｈｕｎｇ　ＤＴ，Ｋｏｒｎ　Ｔ，Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉ－ｔｈｙｍｏ—　ｃｙｔｅ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＡＴＧ）ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏ—　ｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｂｙ　ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｍｙｅｌｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆｏｘｐ３＋　［８］Ｋｏｈｍ　ＡＰ，ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＪＳ，Ｍｉｌｌｅｒ　ＳＤ．Ｃｕｔｔｉｎｇ　ｅｄｇｅ：　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃ—ｏｌｄ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ　ＣＤ４＋Ｔ　ｅｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘ　ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　Ｅ　Ｊ］．Ｊ　Ｉｍ—　ｍｕｎｏｌ，２００４，１７２（８）：４６８６—４６９０．　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，１９（８）：　】００３一］０］Ｏ　［９］Ｈｉｒａｔａ　Ｓ，Ｍａｔｓｕｙｏｓｈｉ　Ｈ，Ｆｕｋｕｍａ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅ—　（上接第１００页）　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（６）：１１２１—１１３３．　表达，可能的原因为完全福氏佐剂中卡介苗成分刺　激胶质细胞和巨噬细胞而产生了少量Ｔｈ１７／ＩＬ一　１７，但因缺乏特异抗原刺激，炎症反应未进一步扩　［６］胡珏，黄颉，杨欢等．树突状细胞负载Ｔａ１４６—　１６２对ＴＣｈＲ预致敏Ｔ细胞免疫反应的影响［Ｊ］．中　国神经免疫学和神经疾病杂志，２００６，１３（７）：８２—８５．　大。已有研究结果也提示Ｔｈｌ７在一般感染性炎　性疾病中也有重要作用［８］。　参考文献　［７］Ｋｒａｋｏｗｓｋｉ　Ｍ，Ｏｗｅｎｓ　Ｔ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｎ一７　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｒｅｓｉｓｔ—　ａｎｃｅ　ｔｏ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｎｍｍｎｏｌ，１９９６，２６（７）：１６４１—１６４６．　［８］ＭｃＫｅｎｚｉｅ　ＢＳ，Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ　Ｒ，Ｃｕａ　ＤＪ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ＩＬ一２３一ＩＬ一１７　ｉｍｍｕｎｅ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｉｍｍｕ—　［１］陆正齐，胡学强．实验性自身免疫性脑脊髓炎和多发　性硬化研究的新动向［Ｊ］．中国神经免疫学和神经病学　杂志，２００６，１３（５）：１８１　１８２．　ｎｏｌ，２００６，２７（１）：１７－２３．　［９］Ｗｅａｖｅｒ　ＣＴ，Ｈａｔｔｏｎ　ＲＤ，Ｍａｎｇａｎ　ＰＲ，ｅｔ　ａ１．ＩＬ－１７　ｆａｍｉｌｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃ—　［２］Ｋｏｍｉｙａｍａ　Ｙ，Ｎａｋａｅ　Ｓ，Ｍａｔｓｕｋｉ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．ＩＬ一１７　ｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉ—　ｔｏｒ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅａｇｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，２５：　８２１—８５２．　ｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕ—　ｎｏｌ，２００６，ｌ７７（－１）：５６６　５７３．　［１　０　２　Ｋｏｌｌｓ　ＪＫ，Ｌｉｎｄｆｎ　Ａ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｕ一１７　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒｓ　ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｍｍｕｎｉｔｙ，２００４，２１（４）：４６７—　４７６．　［３］Ｎａｋａｅ　Ｓ，Ｎａｍｂｕ　Ａ，Ｓｕｄｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ—－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｉｎ　ＩＬ——　［１１］Ｍｏｓｅｌｅｙ　ＴＡ，Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ　ＤＲ，Ｒｏｓｅ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ—　１７一ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，１７１（１１）：　６１７３—６１７７．　ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１７　ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄ　ＩＬ一１７　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｖ，２００３，１４（２）：１５５—１７４．　［４］Ｍｏｌｅｔ　Ｓ，Ｈａｍｉｄ　Ｑ，Ｄａｖｏｉｎｅ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．ＩＬ　１７　ｉｓ　ｉｎ—　ｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ａｓｔｈｍａｔｉｃ　ａｉｒｗａｙｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｏｎ—　ｒ１２１　Ｐｅｌｉｄｏｕ　ＳＨ，Ｚｏｕ　ＬＰ，Ｄｅｒｅｔｚｉ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｅｘ—　ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｎｅｕｒｉｔｉｓ　ｉｎ　Ｌｅｗｉｓ　ｒａｔｓ　ｂｙ　ｉｎ—　ｔｒａｎａｓａｌ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｏｕｓｅ　ｉｎｔｅｒｌｅｕ—　ｃｈｉａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，１０８（３）：４３０　４３８．　［５］Ｉｖａｎｏｖ　ＩＩ，ＭｃＫｅｎｚｉｅ　ＢＳ，Ｚｈｏｕ　Ｉ　，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｏｒｐｈａｎ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＲＯＲｇａｍｍａｔ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ—　ｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ＩＬ－１７＋Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｋｉｎ　１　７：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｒｏｌｅ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｎｅｕ—　ｒｏｌ。２０００，１６３（１）：１６５—１７２．