绿色荧光蛋白的结构和应用

【摘要】文章就绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）的一级结构和其发光基团的形成机理进行了分析，给出了GFP的三维结构，并对GFP的优点、改进方法和实际应用进行概括。 【关键词】GFP 结构 改进 应用

2008年10月8日，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）而获得2008年度诺贝尔化学奖。 GFP也因此进入了更多人的视角。

一、 GFP的一级结构和发色团形成机理

GFP是存在于水母、珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，是Shimomura等人从Aequorea victoria中发现的。GFP含238个氨基酸残基，分子量27kDa。野生型GFP的核苷酸序列和氨基酸序列在1992年即被Prasher等人测定[1]。表1为其氨基酸序列。

GFP不含辅基，也不需要辅助因子，在22℃左右，氧条件下，用蓝光光源激发下可发出绿色荧光[2]。其发色团形成于肽链65至67位的Ser-Tyr-Gly，是分子内自催化环化生成的对羟基吡唑啉酮。首先肽链折叠，Gly67酰胺亲核进攻Ser65的羧基，并脱去一分子水形成

咪唑啉酮，最后在氧作用下Tyr66的α，β-键脱氢，此时芳基和咪唑啉酮形成大的共轭体系，发色团成熟，可以吸收辐射并发出荧光[3]。图1为示意图。

GFP氨基酸序列 1 MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT 51 GKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFF 101 KDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNIKGHKLEYNYNSHNV 151 YIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHY 201 LSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK 表 1：GFP的氨基酸序列

图1：GFP发色团形成机理

Tsien还根据发色团组分的不同将野生型GFP和其突变体分为了7类，如含中性酚类和酚离子混合发色团的蛋白，含吲哚类的蛋白，含咪唑类的蛋白，具有大π共轭电子体系的酚负离子的蛋白等[3]。虽然它们的激发波长、吸收波长等荧光性质具有很大不同，但其发光机理都与它们的一级结构密切相关，发色团形成机理类似。

二、GFP的三维结构

虽然1974年，野生型GFP的结晶已被得到，1988年衍射图谱报道，但是野生型GFP的结构直到1996年才被解析出来[4]。GFP的发光基团只占全部序列的小部分，故而大部分序列是用来组成GFP的一条α螺旋链和11条β折叠链的。其结构是圆桶状的，图2为GFP三维结构示意图，α螺旋链沿对角线分布，β折叠链用于构成桶壁。圆桶直径240nm，高420nm。发光基团在α螺旋上，恰位于桶的中心，被很好地保护了起来，这与观察到的GFP相对稳定的现象和实验结果相符［5］。

图 2:GFP的三维结构示意图

三、GFP的优点

GFP自身的巨大优势使之迅速发展并广泛使用。汪恒英等人总结GFP的优点有以下七条[6]：易于检测；荧光稳定；无毒害；具有共用性、通用性；已于构建载体；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。

荧光稳定是具有GFP的生物在长期进化中的生存选择，也成为了GFP可以在科研中实际应用的基础。已经提到从结构上可以看出，GFP蛋白桶状结构对发色团具有良好的掩蔽作用，使发色团不会轻易暴露，极大程度上避免了外界环境引起荧光淬灭的可能。这使得它抗光漂白性良好，对光的耐受性强，对除垢剂、盐、有机溶剂和许多普通酶也具有良好耐受性[6]。

四、GFP的改进

野生型GFP的发色团虽然被有效地保护在了其桶状结构的中心，但是它的荧光性质受环境，如氧化还原条件，pH条件，温度条件等因素的影响依然存在，在一些条件下这些影响还会十分显著 [5]、[7]。这一方面给人们设计相关的传感器探针等提供了可能，但另一方面，也给GFP的使用带来了极大的限制。其次，野生型GFP的两个激发峰光谱（395nm主峰和475nm次峰）对应用也有不利[8]。一个GFP分子只有一个荧光团，有时并不能满足对荧光强度和灵敏度的要求。可以说野生型GFP的稳定性、荧光特性等对生物体在自然环境下的生存已经足够，但对于应用到非自然条件和复杂条件下的科研是远远不能满足要求的，因此对野生型GFP的改进势在必行。

对GFP的改进方法主要有：替换GFP生色团的氨基酸；在基因水平上改进[9]；对启动子进行改进等[10]。对生色团氨基酸的替换是最常见的方法，如将65位的Ser换为Thr（S65T）或者Cys（S65C），将64位Phe换为Leu（F64L）也可以提高1.5到3倍的荧光强度[11]。这些改进对GFP的结构没有大幅度改变，但改良了发色基团的形成。

图 3：第65位氨基酸的替换

图 4：第64位氨基酸的替换

改良后的GFP在激发峰光谱、量子产率、对环境的敏感度等方面都有改变，绿色荧光强度较大的增强绿色荧光蛋白EGFP就是由F64L和S65T两个突变点造成的。改造后的荧光蛋白的光吸收和荧光行为也可能变化，故而突变体的荧光颜色也不仅仅局限于绿色,如罗文新等人对GFPxm改造后获得的突变体橙色荧光蛋白OFPxm，发射峰523nm，为黄绿色，肉眼见蛋白为橙色[12]。另外还有黄色荧光蛋白

（YFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、青色荧光蛋白（CFP）等，此外类似GFP和EGFP，还有相应的增强黄色荧光蛋白（EYFP）和增强青色荧光蛋白（ECFP）等[13]。

利用氨基酸、核苷酸点突变等方式研究GFP的突变体一方面可以进一步了解GFP的结构和功能，而且可以获得适合不同的应用环境和应用方式的荧光蛋白。可以说这些GFP改良体的产生是推动这类物质成为生物化学与荧光分析领域一个广被青睐的标记物的重要原因。

四、GFP及其突变体的实际应用

GFP荧光是应用的核心。GFP的应用主要有两大类，一是作为标记物，利用其发出荧光的特性对分子进行标记，进一步可对对细胞、个体进行标记、定位；或是利用其荧光对环境的反应制造相应的传感器。 （一） 作为标记物的应用

GFP分子量较小，毒性小，对目的蛋白的正常功能、定位等几乎无影响，因此把GFP作为标签融合到目的蛋白上，以研究目的蛋白在活细胞中的定位、迁移、相互作用等已成为一项较为成熟的应用。在应用荧光共振能量转移法（fluorescence resonance energy transfer, FRET）检测蛋白相互作用和蛋白构象变化时，CFP和YFP常被作为FRET的给体荧光团和受体荧光团[10]。

GFP还可作为报告基因使用。将GFP基因连接到目的基因启动子上，既可以通过检测GFP荧光强度得知基因的表达水平。相比构建基因工程载体常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ，GFP不需要利用

酶促催化反应，不需要需要加入外源底物和诱导物，使得操作简便、成本降低。现在GFP已被广泛使用在转基因研究领域中，在转基因动植物筛选和活细胞基因表达的时空成像方面都有重要应用[14]、[15]。

GFP还可作为亚细胞结构的标记物，内质网、高尔基体、细胞膜、线粒体等都可被成功标记。这对于亚细胞结构的实时观测具有重大意义，是细胞筛选、发育机理研究、药物研究等方面的有力方法。

标记还可针对个体。如用GFP对微生物进行标记，可以方便地对微生物进行跟踪、研究[16]；还可以利用GFP及突变体、类似物的标记对生物的迁徙、种群变化等情况进行研究。 （二） 作为传感器的应用

从GFP发色团的形成以及其稳定性等方面来看，pH、温度、氧化还原条件等对其荧光都有影响，这种荧光对环境的响应可以作为传感器的原理加以利用。

pH检测器Phluorin就是一例。Phluorin可以检测活细胞内pH。当pH降低，比率Phluorin最大激发波长从395nm向475nm转移，可用这两个波长处荧光强度的比率来计算pH；盈缺Phluorin在pH＜6条件下475nm峰无荧光。Llopis等人设计了GFP探针，测量了细胞不同部位的pH[17]，图5为不同pH下EGFP的吸收光谱。现在GFP的pH探针还在不断发展，适用范围进一步扩大[18]。

图 5:不同pH下EGFP的吸收光谱

GFP用于Ca2+的指示剂也比较成熟。Ca2+是细胞内常见的第二信使，参与多种细胞过程，对Ca2+的检测具有很重要的实际意义。人们构建了例如Cameleons[19]，GFP-Aeqorin，Camgoroo，Pericams等基于GFP的探针。这些传感器的原理都是在GFP蛋白基础上连接一个对钙离子敏感的肽，如钙调蛋白结合肽（M13），利用这个敏感部位对Ca2+响应后对GFP部分荧光效应的影响来达到钙离子的可视化检测。细胞内氧化还原水平对细胞的生理功能能否正常发挥起到至关重要的作用。Dooley等人设计的GFP突变体roGFP1和roGFP2可以对细胞内氧化还原水平进行实时监测[20]。图6和图七分别为roGFP1和roGFP2在氧化还原态下的荧光激发光谱。

图6：roGFP1荧光激发光谱

图7：roGFP2荧光激发光谱

另外GFP及变体还可以用于检测卤素离子和检测电位。

GFP发现初期经历过曲折的发展，最终其优势被发现、认可，成为现在被广泛应用的一类标记物。这与其结构的天然优势是分不开的。如今GFP的发光机理还并不完全明确，在应用中还有许多不足，可以说其发展还有巨大空间，前景可观。

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