青蒿素类抗疟药作用机理研究述评

青蒿素类抗疟药作用机理研究述评

本文综述了自1972年青蒿素问世以来，研究者们在青蒿素类抗疟药的作用机理方面所做的研究工作，包括采用电子显微镜技术的超微结构病理学研究、采用生化药理学方法研究青蒿素对疟原虫代谢和疟色素凝集的影响，并对氧化损伤及铁离子作用机理的国内外研究情况进行了梗概的讨论。

标签：青蒿素；疟疾；抗疟药；作用机理；述评

青蒿素类化合物是一化学结构新颖的新型抗疟药，是分子中含有一个过氧桥的倍半萜化合物。由于结构独特，所以它的抗疟作用机理也与已知抗疟药迥然不同。

1 青蒿素类化合物对疟原虫超微结构的作用

自20世纪70年代发现青蒿素的抗疟活性之后，学者们除了对青蒿素类化合物的药效学作用进行了深入广泛的研究之外，还对其抗疟作用机理开展了初步的研究。如采用电子显微镜技术观察了青蒿素对伯氏鼠疟原虫超微结构的影响，小鼠口服给药青蒿素剂量为100 mg/kg和800 mg/kg时，青蒿素主要作用于疟原虫的膜系结构，如质膜、食物泡膜、线粒体膜、核膜。其损伤表现为双层膜增宽、成泡状、出现螺纹膜等；内质网呈线状排列，或呈空泡状，或出现瓦解，也见到自噬泡的产生；核膜肿胀，核染色质集聚[1]。1976年和1977年美国学者成功地建立了人体恶性疟连续体外培养方法[2-3]，供他人进行相应的研究工作。

叶氏等[4]采用电子显微镜技术，在观察体外培养人恶性疟原虫正常超微结构的基础上，进一步比较研究了青蒿素和氯喹对疟原虫超微结构的影响[5-6]：疟原虫在青蒿素体外抗疟有效浓度为10-7 mol/L和5×10-7 mol/L作用2 h，其形态学就发生了病理变化，包括细胞膜、线粒体膜及核膜的膜间隙增宽，内质网的肿胀及膜变形等，同时观察到自噬泡的形成，但自噬泡中并未含有富铁的色素团块，而氯喹在作用30 min时便出现大量的自噬泡，而且其中含有大量的色素团块，这是青蒿素和氯喹对疟原虫超微结构影响的最大不同。江氏[7-8]在美国Aikawa领导的实验室用线粒体结构较为明显的P.inui猴疟及体外培养的恶性疟进行电镜观察，进一步证实了青蒿素主要作用于疟原虫的线粒体。此外，张氏等[9]用3H-青蒿素作用于体外培养人体恶性疟原虫，然后进行了放射电镜自显影的观察，结果显示高电子密度扭曲状细丝的银颗粒出现在疟原虫感染的红细胞中，其中2/3出现在疟原虫内。疟原虫内银颗粒的分布为：质膜41%，食物泡膜13%，泡内2%。色素颗粒小，银颗粒所在的疟原虫部位和上述受损的细胞结构是一致的。这提示由于青蒿素分布在疟原虫的一些膜结构中，故造成了疟原虫的膜系统发生病理变化。青蒿素衍生物如蒿甲醚和青蒿琥酯对疟原虫超微结构的作用特点基本上同于其母体药物青蒿素[10]。

除了上述在透射电镜下观察到形态学变化，叶氏等[11]还采用扫描电镜技术，观察了感染伯氏鼠疟的红细胞表面结构以及青蒿素的作用。镜下发现，感染

疟原虫的红细胞内凹明显加深，甚至形成较深的腔窝或者弹孔样的“坑洼”区，这是由于疟原虫代谢旺盛而与血浆进行大量的物质交换所致。上述红细胞表面结构的变化称之为“代谢窗”（metabolic window）。青蒿素对感染红细胞上的代谢窗的结构和数量没有明显影响，这说明青蒿素并非通过损害代谢窗而杀伤疟原虫，同时也说明青蒿素选择性地作用于疟原虫而对宿主细胞并没有明显的影响。

电子显微镜的方法可以对疟原虫细胞器或超微结构进行直接观察，能够观察到药物对虫体内细胞器的损伤及程度，从而为进一步研究其作用原理提供线索和方向。在上述基础上，赵氏等[12-13]认为疟原虫膜系结构含有细胞色素氧化酶，他们采用鼠疟模型研究蒿酯钠对细胞色素氧化酶的影响，结果表明蒿酯钠可以完全抑制膜系结构内细胞色素氧化酶的活性。李氏等[14]认为，青蒿素类药物能够抑制细胞色素氧化酶、干扰膜系统的线粒体功能、妨害虫体消化酶分解宿主血红蛋白成为氨基酸，致使疟原虫无法获得足够的营养和蛋白合成原料而形成自噬泡，导致其崩解而死亡。然而，笔者采用酵母菌和大鼠线粒体分别观察青蒿素对线粒体氧化磷酸化反应的影响，其结果均是阴性（未发表）。总之，青蒿素类抗疟药可以引起疟原虫膜系统形态学上的病理变化是肯定的，然而，一般而言，在形态学改变之前，疟原虫的酶学及其生化代谢等应当首先受到影响，那么在青蒿素的作用下，哪些酶学靶点及生化代谢通路受到影响，膜结构发生异常变化之后，又发生了一系列怎样的“事件”，目前仍不甚清楚。

2 青蒿素对色素凝集的影响

如前所述，疟原虫在氯喹作用下最早出现的形态学变化是疟色素的凝集[5-6]，色素凝集实际上是虫体内自噬泡的形成过程，红内期疟原虫在氯喹作用10～30 min时，胞浆中的小噬泡互相融合，其中细小的色素也随之相互融合成较大的色素颗粒，最后形成较大的自噬泡，其中含有由色素颗粒凝集形成的色素大团块和其他胞浆成分。因此，氯喹的作用机理是和自噬泡的形成密切相关的。英国科学家Warhurst与美国科学家不仅发现了氯喹引起色素凝集（Chloroquine-induced pigment clumping，CIPC）这一病理现象，而且还将之发展成为一种研究抗疟药作用机理的方法和手段[15]。根据抗疟药本身是否引起色素凝集及其对CIPC影响情况，可将抗疟药分成4大类：①4-氨基喹啉类化合物，如阿的平，它们的作用部位类同于氯喹；②奎宁类抗疟药，其本身并不引起色素凝集，但却竞争性地抑制CIPC，这说明此类抗疟药和氯喹相互竞争同一个作用部位；③8-氨基喹啉类化合物，其本身并不引起色素凝集，而且在较大剂量时才能抑制CIPC，而且这种抑制作用是非竞争性的，这类抗疟药原发作用部位不同于氯喹；④叶酸代谢拮抗剂，它们既不引起色素凝集，又不影响CIPC，这类药物的抗疟作用部位和氯喹迥然不同。由此可见，CIPC方法主要包括3个方面的研究内容：①是否引起色素凝集；②能否抑制CIPC；③如果能够抑制CIPC，那么该抑制作用是竞争性还是非竞争性的？根据这一思路和方法学，叶氏等[16]采用体外和体内两种实验方法研究了青蒿素的作用机理，并和氯喹进行比较。结果表明，青蒿素并不引起伯氏鼠疟原虫的色素凝集，甚至在体内实验中给感染小鼠口服青蒿素的剂量增大至450 mg/kg，或在体外实验中当青蒿素的浓度增大至10-3 mol/L都没有观察到色素凝集现象，然而，它对CIPC却具有一定的抑制作用，其抑制作用是不完全的，最高抑制率仅为60%，再增加剂量其抑制率反而降

至50%，而平行对照药盐酸奎宁的抑制率高达90%以上；通过对CIPC剂量反应曲线和青蒿素对CIPC影响的剂量反应曲线的比较和统计分析，前者回归方程的斜率分别为3.49（体内实验）和3.38（体外实验），而后者则分别为1.17和1.21。经统计处理，二者差异具有统计学意义（P＜0.05）。同样，青蒿素的剂量反应曲线也完全不同于盐酸奎宁的曲线形态。此外，通过时-效关系研究表明，如果青蒿素先于氯喹给药（提前40 min给药）或者在体外实验中，青蒿素和氯喹同时加入疟原虫培养物中，青蒿素对CIPC则具有较明显的抑制作用，这可能是由于青蒿素损伤了虫体的膜系统，妨碍了其后氯喹透过膜系统作用于其受体；而当氯喹首先进入虫体和其受体发生作用，此时再给予青蒿素几乎没有抑制CIPC的作用。上述结果表明，青蒿素的抗疟作用部位和机理均不同于氯喹。疟原虫色素/血色素是人血红蛋白被疟原虫消化分解后的产物，Warhurst认为抗疟药如喹啉、氯喹的氮原子可与疟原虫血色素结合发挥抗疟作用，故认为氮原子是和色素结合并发挥作用的必须结构，但青蒿素类抗疟药并无氮原子，却可以部分地抑制CIPC，这一实验结果显然不支持英国科学家结论，从而使Warhurst等重新考虑上述结论。

3 对生化代谢的影响

为了更深入地了解青蒿素类抗疟药的抗疟机理，势必需要研究药物对疟原虫生化代谢等方面的作用。只有阐明其对虫体生化通路和代谢的作用，才能更好地理解上述形态学的变化和色素凝集的特征。

3.1 核酸代谢

疟原虫能够自身合成嘧啶类从而满足虫体核酸合成代谢需求，而疟原虫不能自身合成嘌呤类化合物，需要一些外源性嘌呤类作为其核酸合成的原料，因此，采用若干嘌呤类的前体物不仅可以观察药物对虫体核酸代谢的作用，而且这些前体物还可以作为观察疟原虫生长繁殖的一个指标，通过它们掺入虫体核酸的多寡，反映出疟原虫生长、繁殖及生命的状态，据此将其发展成为一个定量测定抗疟药抗疟效价的药效学方法[17]。叶氏等[18]同时采用氚标记的腺苷和次黄嘌呤两种嘌呤前体物，在体外培养人体恶性疟实验中，通过比较3H-腺苷和3H-次黄嘌呤掺入恶性疟原虫核酸中放射量的变化，观察青蒿素对疟原虫核酸代谢的影响，同时定量地测定青蒿素的抗疟效价。结果表明，青蒿素可明显地抑制两种核酸前体掺入虫体核酸的合成代谢，这说明在青蒿素的作用下，疟原虫的核酸代谢严重受损。在此基础上测量了青蒿素的抗疟效价，青蒿素对正常敏感株和耐药株的IC50分别为2.8×10-8 nmol/L和3.0×10-8 nmol/L。上述结果不仅提示青蒿素干扰了疟原虫的核酸代谢，还说明对于人体恶性疟而言，青蒿素和氯喹没有交叉耐药性，这一结果和伯氏鼠疟实验结果稍有不同。在伯氏鼠疟实验中，发现青蒿素和氯喹具有低度的交叉耐药性，而在人体恶性疟二者则没有交叉耐药性。似乎恶性疟的结果更符合临床实际情况。此外，这两种疟原虫产生耐药性的机制也不尽相同。伯氏鼠疟需要不断用氯喹刺激才能维持对氯喹的耐药性，而上述体外实验所采用的恶性疟对氯喹的耐药性属于基因突变，一旦产生耐药性则永久保留这一生物学的特征，而不需要氯喹不断刺激疟原虫。李氏等[19]采用上述同样的体外培养恶性疟的方法，以3H-次黄嘌呤为指标，研究了青蒿素及其衍生物的抗疟作

用，结果发现青蒿素类药物对疟原虫核酸代谢具有明显的抑制作用。赵氏等[12]的鼠疟实验结果也表明，青蒿素类抗疟药的作用机理主要是抑制了疟原虫的核酸代谢而不是蛋白质代谢。

3.2 蛋白代谢

顾氏等[20]用[3H]-异亮氨酸和[3H]-次黄嘌呤分别为人恶性疟原虫蛋白质和核酸合成代谢的前体物进行实验，观察了青蒿素及其衍生物双氢青蒿素和蒿甲醚对体外培养的恶性疟原虫蛋白和核酸合成代谢的影响，从生化代谢角度研究药物的抗疟作用机制。加药不到1 h，3种抗疟药即明显地抑制[3H]-异亮氨酸的掺入，阳性对照药真核细胞蛋白合成抑制剂放线菌酮在3×l0-5 mol/L浓度时，也显示出明显的抑制掺入作用。青蒿素、双氢青蒿素、蒿甲醚及阳性对照药在8 h内对原虫率均无可见的影响。异亮氨酸是疟原虫感染红细胞蛋白合成的主要外源性氨基酸，因此，它的掺入可作为疟原虫蛋白合成代谢的一个观察指标。青蒿素类药物在其作用早期便对虫体蛋白合成代谢具有明显的抑制作用。然而，在相同的条件下，上述3种青蒿素类药物对疟原虫作用2 h后才对[3H]-次黄嘌呤掺入虫体核酸的过程表现出抑制作用。其对核酸代谢抑制作用发生比较迟缓，晚于蛋白代谢抑制作用约1 h。这表明青蒿素类药物对蛋白代谢的抑制作用可能是直接而不是继发反应，换言之，在青蒿素类抗疟药作用下，蛋白代谢可能是最早发生的原发性异常变化。叶氏等[21]采用疟原虫同步化技术，将体外培养的人恶性疟原虫控制在同步化生长的水平，然后研究药物对疟原虫不同发育阶段（环状体、滋养体、裂殖体等）的选择作用，发现疟原虫的蛋白质合成最旺盛的滋养期对青蒿素最敏感，而核酸合成最活跃的裂殖体期次之。这些结果提示，从疟原虫的生化代谢角度来看，青蒿素类抗疟药先是阻断了疟原虫的蛋白合成代谢，而继发性地引起核酸代谢的障碍。然而，赵氏等[12]的鼠疟实验表明，青蒿素类抗疟药的作用机理主要是抑制了疟原虫的核酸代谢而不是蛋白质代谢。同时，顾氏等[22]在无细胞蛋白合成实验系统中，发现青蒿素类抗疟药对蛋白合成代谢并无任何影响作用；药物对伯氏疟原虫珠蛋白酶活性及游离氨基酸活性实验结果也提示，青蒿素类药物对伯氏鼠疟原虫的珠蛋白酶和氨基酸水平均没有影响，这说明它们对蛋白代谢没有明显作用。上述完全不同的结果提示，单纯靠一种指标或一种实验方法很难确定药物的作用机理，因为一个代谢指标的变化究竟是原发性还是继发性的，单靠一种实验方法是不能回答的，只能通过一系列的实验来探索和证实，然而迄今为止青蒿素类药物的抗疟作用机理仍然不甚明了。

4 自由基和氧化损伤假说

由于青蒿素类抗疟药化学结构中含有一个过氧基团，而且一旦该过氧桥结构被破坏，其抗疟活性便随之消失。这种结构特点使人们很容易联想，它们的抗疟作用机理可能和它们在体内产生游离基和活性氧有关。因此，合乎逻辑的推理是，青蒿素类抗疟药特异性地浓集在疟原虫细胞内并释放出活性氧或产生自由基，从而对疟原虫的膜系统或生命大分子产生氧化损伤。然而目前尚缺乏足够的实验证据支特这种假说，尽管也积累了一些零散的实验依据。不少科研人员实验表明青蒿素类抗疟药可以产生自由基，其中靳氏等[23]采用电子自旋共振波谱法测定青蒿琥酯在体内外代谢转化过程中产生自由基情况的实验结果肯定了上述假说，不

仅如此，产生的自由基进一步引发脂质过氧化和组织损伤。使用抗氧化剂维生素E可以抑制该药自由基的产生，减轻脂质过氧化及组织损伤。虽然该文是一篇研究青蒿琥酯的毒理学文章，但至少可以表明青蒿素类药物在体内可以产生自由基，既然这些自由基可以造成机体的组织损伤，也有可能杀伤疟原虫。有人提出疟原虫的死亡可能是青蒿素在体内产生的活性氧引起的[24]。还有人提出青蒿素产生的自由基作用于疟原虫蛋白质引起疟原虫蛋白失活[25]。现在占主流的是“两步作用学说”：首先，青蒿素的过氧基结构被活化产生自由基；然后自由基作用于疟蛋白，形成共价复和物，使疟蛋白失活从而产生抗疟活性[26]。此外，有人发现青蒿素类的抗疟作用可能是通过作用于疟原虫的血色素而实现的[27]。青蒿素类抗疟药的抗疟活性可以被氧化剂（包括过氧化氢酶）、自由基清除剂（如维生素E）所抑制。青蒿素-血红素复合物能氧化细胞膜上的巯基，而单独使用青蒿素则不能氧化细胞膜上的巯基，所以青蒿素类化合物通过血红素铁离子的氧化还原作用而产生抗疟活性。其中的铁离子起着至关重要的作用，铁离子能催化有机过氧化物的分解而产生自由基，这些自由基可以损伤有机体的膜系结构或者烷化生物大分子，从而造成生物体的死亡。青蒿素类抗疟药就是过氧化物，所以疟原虫中的游离铁，尤其是血色素的铁可能催化青蒿素类药物中的过氧桥断裂而产生自由基。自由基再对生物大分子发生损伤作用（烷化、攻击巯基等），从而达到抗疟药效。5 其他

Lee P等[28]应用电镜结合X-能谱仪的微量分析技术，研究了在青蒿素作用下的人体恶性疟原虫细胞内离子浓度变化，结果表明，反映疟原虫细胞膜代谢的磷离子浓度明显降低，同时引起疟原虫体内钾离子浓度的降低和钠离子浓度的增加。此外，有的学者还发现青蒿素类抗疟药对机体的免疫系统具有一定的调节作用[29]，但究竟是免疫增强还是免疫抑制尚未形成一致的结论，但从青蒿素及双氢青蒿素可以治疗盘状红斑狼疮来看[30]，似乎青蒿素类具有一定的免疫抑制作用。但它们的免疫调节作用在抗疟作用中的机理仍然不清楚。

参考文献：

[1] 中医研究院中药所药理研究室.青蒿的药理研究[J].新医药学杂志， 1979，8（1）：23-32.

[2] Trager W， Jensen JB. Human malaria parasites in continuous culture[J]. Science，1976，193（4254）：673-675.

[3] Jensen JB， Trager W. Plasmodium falciparum in culture：Use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method[J]. Journal of Parasitology，1977，63（5）：883-886.

[4] 叶祖光，李泽琳，傅湘琦，等.体外培养的恶性疟原虫的超微结构[J].微生物学报，1983，23（2）：175-178.

[5] 叶祖光，李泽琳，傅湘琦，等.青蒿素和氯喹对体外培养的红内期恶性疟原虫超微结构的影响[J].中医杂志，1982，28（4）：65-67.

[6] Ye ZG， Li ZL， Li GQ， et al. Effects of Qinghaosu and chloroquine on the ultrastructure of the erythrocytic stage of P. falciparum in continuous cultivation in vitro[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，1983，3（2）：95-102.

[7] Jing JB， Jacobs G， Liang DS， et al. Qinghaosu-induced changes in the morphology of Plasmodium inui[J]. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene，1985，34（3）：424-428.

[8] Maeno Y， Toyoshima T， Fujioka H， et al. Morphologic effects of artemisinin in Plasmodium falciparum[J]. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene，1993，49（4）：485-491.

[9] 张奎汉，李泽琳.3H-青蒿素在体外培养人恶性疟原虫内的浓集作用[J].中药新药与临床药理，1992，3（4）：19-21.

[10] 陈乐义，胡明，张起麟.蒿甲醚对小鼠体内伯氏疟原虫超徽结构的影响[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1988（S1）：18-19.

[11] 叶祖光，李泽琳，李桂琴，等.青蒿素对感染伯氏疟原虫红细胞及游离疟原虫表面结构的影响[J].寄生虫学与寄生虫病杂志，1986，4（4）：260- 261.

[12] Zhao Y， Hall IH， Oswald CB， et al. Antimalarial agents.Ⅲ. Mechanism of action of artesunate against Plasmodium berghei infection[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1987，35（5）：2052-2061.

[13] Zhao Y， Hanton WK， Lee KH. Antimalarial agents， 2. Artesunate， an inhibitor of cytochrome oxidase activity in Plasmodium berghei[J]. Journal of Natural Products，1986，49（1）：139-142.

[14] 李国栋，周全，赵长文，等.青蒿素类药物的研究现状[J].中国药学杂志，1998，33（7）：385-389.

[15] Warhurst DC， Homewood CA， Baggaley VC. The chemotherapy of rodent malaria. XX. Autophagic vacuole formation in Plasmodium berghei in vitro[J]. Annals of Tropical Medicine and Parasitology，1974，68（3）：265-281.

[16] Ye ZG， Li ZL. Effect of Qinghaosu on choloroquine-induced pgment clumping[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine， 1981，1（2）：105-112.

[17] Desjardins RE， Canfield CJ， Haynes JD， et al. Quantitative assessment of antimalarial activity in in vitro by a semiautomated microdilution technique[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1979，16（6）：710-718.[18] Ye ZG， Van DK， Wimmer M. Effect of artemisinin （qinghaosu） and chloroquine on

drug-sensitive and drug-resistant strains of Plasmodium falciparum malaria：use of [2，8-3H]adenosine as an alternative to [G-3H]hypoxanthine in the assessment of in vitro antimalarial activity[J]. Experimental Parasitology，1987，64（3）：418-423.

[19] Li ZL， Gu HM， Warhurst DC， et al. Effects of qinghaosu and related compounds on incorporation of [G-3H] hypoxanthine by Plasmodium falciparum in vitro[J]. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene，1983，77（4）：522-523.

[20] Gu HM， Warhurst DC， Peters W. Rapid action of Qinghaosu and related drugs on incorporation of [3H] isoleucine by Plasmodium falciparum in vitro[J]. Biochemical Pharmacology，1983，32（17）：2463-2466.

[21] Ye ZG， Carolyn D， Knox VD. Selective effect of qinghaosu on different stages of Plasmodium falciparum in vitro[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，1993，2（1）：64-68.

[22] 顾浩明，朱梅英，奚国良，等.13个化合物对伯氏疟原虫珠蛋白酶活性及游离氨基酸活性的影响[J].中国药理学报，1987，8（5）：460-464.

[23] 靳永刚，滕翁和，孙存普.自由基与青蒿琥酯毒性机理[J].中国药理学与毒理学杂志，1989，3（2）：138-142.

[24] Kamchonwongpaisan S， Meshnick SR. The mode of action of the antimalarial artemisinin and its derivatives[J]. General Pharmacology， 1996，27（4）：587-592.

[25] Lee C H， Hong H， Shin J， et al. NMR studies on novel antitumor drug candidates， deoxoartemisinin and carboxypropyldeoxo- artemisinin[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2000，274（2）：359-369.

[26] 徐进，郑莹，张睿，等.青蒿素类药物作用机制的探讨[J].药学进展，2002， 26（5）：274-277.

[27] Li Y， Wu YL. A golden phoenix arising from the herbal nest- A review and reflection on the study of antimalarial drug Qinghaosu[J]. Frontiers of Chemistry in China，2010，5（4）：357-422.

[28] Lee P， Ye Z， Van DK， et al. X-Ray Microanalysis of Plasmodium and infected red blood cells：Effects of Qinghaosu and Chloroquine on potassium， sodium， and phosphorus composition[J]. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene，1988，39（2）：157-165.

[29] 藏其中，郑振源，齐尚斌，等.青蒿素对免疫功能的调节作用[J].核技术，

1984，7（2）：55-56.

[30] 庄国康，朱毅，何立文，等.青蒿治疗盘形红斑狼疮[J].新医药学杂志， 1979，8（6）：359-362.