植物组织培养实习报告

辽宁工程技术大学

本科生实习报告书

教学单位 辽宁工程技术大学

专 业 生物技术

班 级 2012-1班

学生姓名 徐海冬

学 号 **********

指导教师 李娜

为使我们掌握植物组织培养技术的基础知识和相关基本技术在实践中的应用情况，消化和理解课堂所学理论知识，为进一步学习打下基础，学校经过商议给予了我们在实验室实习的机会。我们通过课程实习加深理解和巩固了课堂上所学知识，熟悉了植物组织培养的基本操作技术，提高了自己动手能力及观察分析能力，逐渐形成了科学、严谨、实事求是的自我素养。实习的主要内容由校内实习和企业参观两部分组成，其中校内实习部分要进行培养器皿的洗涤与环境的消毒，植物组织培养基母液的配制与保存，植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌，外植体的消毒及其愈伤组织的诱导，康乃馨茎段诱导不定芽，万寿菊茎段诱导生根等实习任务；企业参观部分包括植物组织培养室参观与设计。实习过程中我们初步掌握了植物组织培养的基本原理和方法，掌握植物组织培养培养基的配制、灭菌和无菌操作流程，了解植物组织培养室的构造和各种设备的功能。 一月5日在教研室，老师带领我们进行了实习动员，讲解了实习的重要性和强调了实习过程中应该注意的问题。带领我们查阅了大量的资料，为后来的实习操作提供了良好的理论基础，让我们在理论方面初步了解到了实验关键的步骤。 一 实习的主要内容 1植物组织培养室参观与设计 我们实习的企业为辽宁申博生物技术有限公司，该公司成立于2003年6月，位于阜新国家高新技术产业园区,是一家专门从事马铃薯和出口蔬菜生产、加工、销售的科技型民营企业。此公司自成立以来，始终坚持以科技创新作为企业发展的推动力量，不断开发新产品，拓宽新市场，企业得到了发展迅速，现已形成了集研发、种植、生产、加工、销售于一体的产业格局。 该公司注册资金为258.8万元，经过几年的发展，现有员工156人,已形成近2800万元的资产规模，2005年实现销售收入2068万元，实现出口创汇255万元，实现利润215万元，银行信用等级为AA＋级，目前已成为阜新乃至东北地区规模最大的加工型专用马铃薯产业化生产企业。公司先后被评为“阜新市农业产业化重点龙头企业”、“阜新市农业标准化示范基地”、“辽宁省十大农机示范基地”、“优质农产品基地”和“农业标准化示范基地”。 作为阜新市转型之初成立的一家农业产业化企业，该公司自成立之日起就承担起了促进阜新经济转型的重要社会责任，本着“公司+基地+农户”的发展模式，以公司与农户的利益共享为目标，适应阜新经济转型的需要，不仅在安排下岗职工再就业方面充分发挥了作用，而且在提升阜新农业生产总体科技水平，特别是加工型专用马铃薯育种和产业化生产方面也发挥了重要的引领和带动作用。 先由老师集中介绍组织培养实验室守则及有关注意事项，讲解本次实习的目的、仪器设备和器皿用具的名称等。再逐一讲解组培实验室的构建情况，包括准备室、缓冲室、无菌操作室、培养室、驯化室、温室等使用的各种仪器设备和器皿用具的名称用途。 2培养器皿的洗涤与环境的消毒 2.1器皿与用具的洗涤 新购置的玻璃器皿使用前要先用1%稀HCL浸泡一夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗后，再用蒸馏水冲洗1次，晾干后备用。对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后，倒去残渣，用毛刷刷去瓶壁上的培养液和病斑后，再用清水冲洗干净，蒸馏水冲淋一遍，晾干备用。清洗后的玻璃器皿，瓶壁应透明发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。 对于较脏玻璃器皿的洗涤：采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。对于带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。 2.2玻璃器皿、用具及环境的灭菌 将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具，用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100℃时，启动箱内鼓风机，使电热箱内的温度均匀。当温度升至150℃时，定时控制40min（或120℃定时120min）,达到灭菌目的。 用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外，在接种过程中还常常采用灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。 2.3环境的消毒 每次使用前，将配好的20%新洁尔灭溶液倒入喷雾器中，对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。然后开启紫外灯开关，照射15～30min，一般紫外线消毒后不要立即进入，应在关闭紫外灯15-20min后进入室内。 消毒灭菌的方法：首先将房子关闭，定期用甲醛和高锰酸钾2：1的比例定期熏蒸灭菌24h或用70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾，封闭消毒期间不宜进入消毒空间。 3植物组织培养基母液的配制与保存 母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO42-,Ca2+,Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。 配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。包括大量元素母液（浓缩10倍）、微量元素母液（浓缩100倍）、铁盐母液（浓缩200倍）、有机物母液（浓缩100倍）、生长调节物质（激素）母液（浓度1mg/ml）。 4植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌 植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择一个符合实验材料需要的适宜培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物质、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。 配置过程中要先量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基，先量取约700 ml体积的水。再根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可在加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。 5无菌操作技术——外植体的消毒与接种 我们按老师的要求进行操作，用肥皂洗净双手，穿上灭过菌的专用实验服、帽子与鞋子，进入接种室。按要求打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，用酒精棉球擦拭双手，然后用 70% 酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面。用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸 95% 酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。按要求修整接种材料，除去不用的部分，然后进行外植体消毒，将种子或其他培养材料放到培养基上。接种结束后，按要求清理和关闭超净工作台，并用 70% 酒精擦拭工作台面。 6外植体的消毒及其愈伤组织的诱导 我们按要求将胡萝卜用自来水冲洗干净，用刮皮刀除去表皮1-2cm，横切成大约10mm厚的切片。用70%酒精处理15秒后，无菌水冲洗一遍，再用0.1%升汞溶液浸泡6-8min，无菌水冲洗3-4次。再将胡萝卜片平放入培养皿中，一手用镊子固定胡萝卜片，一手用打孔器按平行于组织片垂直轴方向打孔。每个小孔应打在靠近微观形成层的区域，打穿组织。再用镊子取出圆柱体，放入培养皿中，用刀片切除圆柱体两端各2mm长的组织。将剩下的组织切成3个各约2mm厚的小圆片，将制备好的小圆片转移到装有无菌水的培养皿中。用镊子将圆片转到灭菌的滤纸上，将圆片两面的水分吸干，并立即植到培养基表面。将培养物置于25℃温箱中培养，可同时将一部分放到光下培养，比较光下和暗处对诱导愈伤组织的反应。 培养几天后，我们观察发现外植体表面开始变得粗糙，有许多光亮点出现，经查阅资料了解到这是愈伤组织开始形成的症状。在数周培养后，将长大的愈伤组织切成小块转移到新的培养基上，用放大镜观察愈伤组织表面特征。 7康乃馨茎段诱导不定芽 主要包括无菌操作的准备、外植体消毒、外植体制备、外植体接种和后期的培养观察 我们按要求将培养基、无菌水、及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯，照射消毒。用纱布吸取75%酒精擦手，擦拭超净台、培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，灼烧接种工具灭菌，冷却备用。选取香石竹叶腋间生出的侧芽,自来水冲洗半小时，用解剖刀切取所需组织，放入培养瓶中，用75%的酒精浸泡消毒30s,将材料移入0.1%升汞溶液浸泡10min,然后在超净台内用无菌水冲洗3—4次。将消毒好的材料用无菌滤纸吸去多余的水份,然后在无菌超净工作台上，借助解剖刀剥离茎尖，剥取茎尖大小通常在0.3mm左右。用灭菌过的镊子将切好的外植体接种到配置好的接种培养基上，每瓶接2-3块 。接种完成后盖上瓶盖，贴标签，注明材料名称、接种日期和姓名。将培养瓶表面用酒精擦拭消毒，置于培养室培养。香石竹的培养条件为温度25±1℃,一昼夜光照16h,光照强度2000lx。10天后,大部分茎尖开始萌动，逐渐长大，20天左右即可长成一小丛植株。 8菊花茎段诱导生根 主要包括无菌操作的准备、外植体消毒、外植体制备与接种、后期的培养观察 我们按要求将培养基、无菌水、及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯，照射消毒。用纱布吸取75%酒精擦手，擦拭超净台、培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，灼烧接种工具灭菌，冷却备用。选取无病虫害、生在健壮的茎尖和茎段，75 %酒精处理20～30 s，再用无菌水冲洗3～5 次，转入0.1 %升汞溶液浸泡7～10 min，再用无菌水冲洗4～6 次，用滤纸吸干水分。将消毒好的材料用无菌滤纸吸去多余的水份，用剪刀将外植体茎段切成1 cm 长小段，水平放置接种，老师要求我们要注意形态学上下端。后要盖上瓶盖，贴标签，注明材料名称、接种日期和姓名。 将培养瓶表面用酒精擦拭消毒，接种完成后即转入培养室。万寿菊的培养条件为温度22～28 ℃，光强1000～4000 Lx。两周即可生根。 二 个人实习总结体会 通过这次实习，我初步掌握了植物组织培养的基础知识和注意事项，在实习过程中我对自己要求很高，每天不迟到不早退，积极地按要求进行实验操作和找仪器药品，为同学和老师节省了大量的时间。实习过程中我们严格按照老师的要求进行操作，认真听老师讲注意的事项和实验操作的关键步骤，做到在理论上严格把握操作中牢记于心。药品配置用电子天平精确的称量，即要求我们有足够的耐心和细心，培养了我们严谨的科学态度和标准的实验操作技能。培养基母液的配置过程中，电子天平难以达到所要求的标准，我们就扩大了培养基中物质的浓度，再通过计算称量出所要求的药品。这样就在总体上达到了植物组织所要求的浓度，不仅方便了称量过程也对培养基的浓度精度有了很大的提高。这是一种处理问题的方法，是扩大数据分析问题的一种思想，这值得我们去学习去理解去体会。实验操作中，我们秉着认真负责的态度进行试验步骤，实验前每一个步骤在心里都会认真的体会，争取不在实验过程中出现失误。这培养了我们用心体会试验步骤的能力，用心体会每一个试验的关键步骤。 通过本次的实习，我明显的感觉到自己还存在一些不足的地方，主要表现在一些基础专业知识不熟，一些的专业知识欠缺。一些仪器操作原理操作方法和注意事项不是很明确，一些实验的操作过程还没有熟练掌握，一些特殊的器皿和药品不能很好地找到，一些实验步骤不能很好地分配，浪费了很多的时间。实验操作过程中不能按要求达到老师要求的标准，在实验结果上出现了失败，既费了时间也浪费了实验材料。实验过程中缺乏足够的耐心和细心，对一些本可以达到的试验精度没有按照要求去尽力实现，造成较大的实验偏差和现象不明显。 通过本次实习，我既学会了一些课本上学不到的知识和实验的操作手法，也认识到了自己所欠缺的东西，明白了自己所需要的是什么。在以后的学习和生活中，我要积极地学习努力的进取，把握自己所拥有的，积极地争取自己所需要的。积极地参加学校的科研学术竞赛和省级竞赛，在学术上和知识上完善自己，用知识和技能武装自己，在本科生阶段尽量的多学习一些对自己有用的东西，争做模范的大学生。 指 导 教 师 意 见 成绩评定： 指导教师签字： 年 月 日 实 习 单 位 意 见 负责人签字： （单位盖章） 年 月 日 备 注