基于靶向扩增技术的HPV检测方法及其在宫颈癌预防性筛查中应用的研究进展

中应用的研究进展

人乳头瘤病毒（HPV）感染与宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈癌的发生密切相关，且HPV的致病性与其型别密切相关，所以检测和分型对宫颈癌的早期筛查、防治、预后判断等具有重要的临床意义。本文围绕基于靶向扩增技术的HPV检测方法学及其在宫颈癌预防性筛查中应用研究的近期进展进行综述。 1 聚合酶链反应（PCR）检测

PCR检测方法主要采用DNA 聚合酶催化特异性引物来选择性地扩增HPV DNA。对扩增后的DNA 采用不同的方法进行检测。通过计算机辅助设计HPV各型引物后，能够有效特异地扩增相应的型别，是目前应用最广泛的HPV DNA检测方法，应用较多的是使用HPV病毒高度保守序列作为HPV各型别的通用引物，如：MY09/MY11、GP5+/GP6+对于广谱扩增HPV各型是一种有效的手段[1]。主要应用于HPV的筛查，且具有价格低廉，操作方便的优点。 近期Illades-A B等应用MY09/MY11、GP5+/GP6+通用型引物对4150例宫颈标本进行HPV研究，发现在不同宫颈病变中，侵袭性宫颈癌、高度上皮内瘤样病变、低度上皮内瘤样病变及正常组织无病变者，HPV感染检出率分别为100%、83.5%、94.5%和40.9%[2]。可见这一检测方法目前仍然是大规模HPV筛查的首选。 2 实时PCR（Real-time PCR） 2.1实时荧光定量PCR（FQ-PCR）

FQ-PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。

CHEN Gang等[3]对1256位女性的宫颈拭子标本进行HPV DNA实时荧光定量PCR检测，总样本的 HPV阳性检出率为66.96%（841／1256），在正常组415例中，HPV阳性率为31.08%（129／415）；在不同病变组841例中，HPV总阳性率为84.66%（712／841）。在炎症组317例，CINⅠ级193例，CINⅡ级141例，CINⅢ级135例及宫颈鳞癌55例中，HPV感染率分别为69.08%（219／317），90.67%（175／193），93.62%（132／141），97.03%（131／135）和100%（55／55）。各病变组与正常组比较差异有显著性（P<0.01）。且随病变级别增加HPV检出率逐渐上升，检测结果显示人群具有较高的感染率，为临床病情观察和治疗提供可靠依据。

2.2多重实时定量PCR（RTQ-PCR）

多重实时定量PCR（RTQ-PCR）是近年应用较多的研究方法，是在实时PCR的基础上发展起来的，它可根据自己的研究目的设计所需型别的引物和探针，克服了型别有限的不足，使其应用更加广泛。

J-H.Lee等[4]对173例宫颈脱落细胞样本进行RTQ-PCR分析，设计了15个型别的引物和探针，与HCⅡ方法相比较，对于两种方法不一致的标本，用HPV DNA直接测序分析。用HCⅡ和（或）RTQ-PCR方法检测出93例HPV阳性感染者，在93例当中，有92例（98.9%）可用RTQ-PCR和（或）HPV DNA直接测序方法进行HPV基因分型，HCⅡ和 RTQ-PCR方法结果一致率为91.9%。RTQ-PCR克服了HCⅡ不能做HPV基因分型的不足，具有良好的临床检测性能，可望取代HCⅡ，用于病理学检测及HPV疫苗方面的研究。

3 逆转录PCR（RT-PCR） 3.1 RT-PCR

RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析，还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR的精确度更高，且样品用量显著减少，还能同时分析多个差别基因的转录。检测HPV癌基因的早期转录情况，可以早期发现HPV感染，区别宫颈损伤程度。

Paola C等[5]对400例宫颈细胞标本用HCⅡ高危型HPV DNA分析方法检测出高危型HPV感染有245例（61.25%），在Normal、ASCUS、LSIL和HSIL中，其高危型HPV感染率分别为：16.7%、54.7%、83.1%和94.5%。再对这245例阳性标本进行HPV16，18，31和33多重PCR检测， 223例（91.0%）检测HPV阳性。Normal、ASCUS、LSIL和HSIL各组HPV感染率分别为：61.1%、86.9%、93.8%和97.1%。再对223例阳性标本用RT-PCR方法对HPVE6和E7RNA转录产物检测，检测出118例（52.9%），在Normal、ASCUS、LSIL和HSIL中，其HPV E6和E7 RNA转录产物检测率分别为：18.2%、20.0%、48.1%和86.3%。HPV E6和E7 RNA转录产物的检出率随着宫颈病变的程度的增加而增加，表明HPV E6和E7 RNA转录产物检测在肿瘤筛查、病人管理及提供更准确的风险预测方面比DNA检测更有临床意义。 3.2定量反转录-PCR（QRT-PCR）

定量反转录-PCR在RT-PCR基础之上，测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。Chih-Ming Ho等[6]运用QRT-PCR方法对720例液基细胞学标本进行了HPV16，18，31，33，52和58的HPVE6基因mRNA水平和DNA病毒载量研究，其中可用于mRNA定量的阳性标本有239例，146例（61%）检测到HPV16，18，31，33，52或58型的感染，139 例（95.2%）为单一感染，7例（4.8%）为混合感染。HPVE6基因mRNA转录物随着组织病理学侵害严重度的增加而增加，在正常宫颈组织中为（13%），HPV PCR产物直接测序就是将PCR扩增产物直接进行自动化测序，测序结果可以访问网上的免费数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST软件在序列数据库中进行同源性搜索和快速分析，从而确定测序HPV的型别。DNA测序不仅能较准确地确定一个人乳头状瘤病毒的基因型，也能对HPV新亚型或变异情况进行准确的HPV基因型鉴定。

Lee SH等对3222例液基细胞学标本先以MY09/MY11引物进行HPV L1 DNA的PCR扩增，再用GP5+/GP6+做巢式PCR扩增，最后将扩增的产物直接进行自动化测序。结果352例检出有HPV感染，其中92%为检出的35个HPV型别的单一感染，8%为多重感染。最常见的基因型是HPV16（68例），其次是HPV52（25例）。尽管多数HPV16、18、31、33和58的型别可单由MY09/ MY11 PCR检出，但有超过总人数一半（53.7%），189例受检者的HPV检出依赖于巢式PCR检测。虽然因HPV变异，签名序列未能与Genbank数据库内的序列“100％的一致”，但所有型别均通过签名序列得到了确认。研究者认为，检测成功的关键是，研究人员必须熟悉L1基因的签名序列在不同HPV基因型内的位置，基因的变异，以便确定型别[7]。 5 杂交技术 5.1杂交技术

杂交技术是将PCR产物固定在膜（硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等）上，经80℃烘烤或紫外光照等处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子杂交，用放射自显影或

非放射性显色检测，可做定性或半定量分析。广泛应用于病原体检测、基因突变检测及基因分型等多个方面，具有潜在的临床应用价值。

蒋卫等[8]将4型 HPV（16、51、54和56）探针3′尾端加地高辛标记，探针只能与相同型别的 HPV质粒杂交并显色 ，收集63例第二代杂交捕获（HCⅡ）阳性和18例HCⅡ阴性的宫颈脱落细胞保存液标本，采用HPV通用引物MY11/09对所有标本L1区基因序列进行PCR扩增，利用地高辛标记探针杂交法对PCR产物进行检测分型；同时利用实时荧光定量PCR对这81例标本进行检测，将两者的检测结果进行比较。地高辛标记探针杂交法检测出HCⅡ阳性标本中HPV16型40例，HPV51型2例，HPV56型2例，分别占HCⅡ阳性标本的63.5%、3.2%和3.2%；HCⅡ阴性标本中检测出HPV16型1例；实时荧光定量PCR法检测出HCⅡ阳性标本中HPV16型39例，HPV51型2例，HPV56型2例，占HCⅡ阳性标本的61.9%、3.2%和3.2%，HCⅡ阴性标本中检测出HPV16型1例；重复性检测显示两种方法检测4型HPV感染的变异系数（CV）为0～1.45%和0～1.50%，检测标本中4型感染的符合率为97.5%～100%。得出PCR联合地高辛标记探针杂交法具有较好的灵敏度和特异性，可检出HCⅡ漏检的型别，对临床HPV分型检测亦有不错的应用价值。 5.2反向杂交技术（Reverse hybridization）

反向杂交技术是利用固定寡核苷酸探针，在液相中同PCR 产物杂交后进行检测。该技术使PCR扩增产物可以同时和多条寡核苷酸探针进行杂交。将探针固定在膜上呈点状，称为反向斑点杂交(RDB)；将探针固定在膜上呈平行线状排列的，称为线性探针分析法(LA) [9]。 反向斑点杂交法是在膜条不同位点上能与不同靶序列严格配对的特异性寡核昔酸探针，在特定温度条件下与PCR产物进行杂交,经洗膜、显色检测多个基因。潮州凯普人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒[10]使用反向斑点杂交技术，利用导流杂交原理，在探针固定在膜上，酶标液与显色液NBT∕BCIP反应，结果阳性点位清晰可见的蓝紫色圆点，可一次性快速检测中国人群HPV感染95%的21种HPV亚型的基因分型。Zheng-Rong Sun等对4780例宫颈标本进行HPV DNA检测，结果2260例（47.28%）检测出感染了HPV，1529例（67.65%）为单一感染，731例（32.35%）为混合感染。其中最常见的HPV型别是HPV16，检出率为19.64%，其次为HPV58、HPV52、HPV33、HPV53 、HPV31。HPV18却只有86例（1.08%）的检测出。宫颈炎2919例，1041例（35.66%）感染；未确定意义的非典型鳞状细胞（ASCUS）282例，154例（54.61%）感染；宫颈上皮内瘤变（CIN）1308例，839例（64.14%）感染；原位癌（CIS）117例，98例（83.76%）感染；宫颈癌（CC）154例，128例（83.12%）感染。

HPV16单一感率在宫颈癌中比CIN（χ2=93.4）和对照组（χ2=50.8）（P＜0.05）高很多，且具有显著差异性[11]。 6 基因芯片技术（Genechip）

基因芯片是生物芯片的一种，又称为DNA芯片，c-DNA 微阵列(c-DNA microarray)，是指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的寡核苷酸片段或基因片段（靶探针），按矩阵方式高密度固定在玻璃、硅片、特制纸张等支持物上，借助碱基互补配对原理，与荧光、生物素或同位素标记样品进行分子杂交，然后将未互补结合反应的片段洗去，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机分析软件对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，从而迅速得出需要的信息[12]。

Kim等[13]研究开发了一种新型的DNA芯片，包括HPV L1和E6∕E7基因序列在内的42种人乳头状瘤病毒多聚核苷酸探针，能检测所有感染肛门与生殖器HPV 型别。他们分别用HPV L1和E6∕E7 基因测序方法和基因芯片方法对100例宫颈癌标本进行了对比检测，结果HPV L1基因测序方法检出有88例感染；用HPV L1和E6∕E7基因测序方法检出98例感染，其中有1例为混合感染；而用基因芯片检出亦为98例感染，但其中有7例为混合感染。与HPV DNA直接测序方法相比，HPV DNA芯片在混合感染检出方面具有明显优势。 7 问题与展望

近年来，随着HPV-DNA检测及分型方法的迅速发展，在宫颈癌及癌前病变的预防性筛查，协助诊断，判断预后等方面发挥了重要作用。在宫颈癌高发地区，以HPV检测为宫颈癌的筛查手段更具有实际意义的。但是，随着HPV的检测目的不同，适用的方法也就不同。因此存在的问题是我们有某种需求，但没有合适的方法。从经济、方便、最安全和最有效的角度考虑，HPV最优化的大规模筛查检测方法是当前存在的主要问题，如何优化检测方法，使普通医院、普通妇女都能无负担地更好地进行HPV检测。总而言之，HPV的检测方法仍需要不断改进以适应日益提高的临床及科研需求。 参 考 文 献

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