申请上海交通大学硕士学位论文
复合抗氧化剂对动物氧化应激与自由基代谢的影响
学 校：院 系：学 号：作者姓名：导 师：学科专业：答辩日期：
上海交通大学 农业与生物学院 1071509026 韩雪 徐建雄 教授 动物营养与饲料科学 2010年 1 月22日
上海交通大学农业与生物学院
2010年 1月
A Dissertation Submitted to Shanghai Jiao Tong University
for Master Degree of Agriculture
EFFECTS OF COMPOSITE ANTIOXIDANTS ON
OXIDATIVE STRESS AND FREE RADICAL METABOLISM
IN ANIMALS
Author： Mentor： Specialty：
Date of Oral Defense：
Han Xue
Prof. Xu Jianxiong
Animal Nutrition and Feed Science January 22, 2010.
School of Agriculture and Biology Shanghai Jiao Tong University
January, 2010
本研究得到下列项目资助
国家自然科学基金（No. 30972103）
复合抗氧化剂对动物氧化应激与自由基代谢的影响
摘 要
目的：氧化应激是动物生产常见的机体状态，严重影响着机体的健康和动物生产性能的发挥。本试验通过复合抗氧化剂在动物氧化应激状态下对机体自由基代谢水平的调控，研究复合抗氧化剂、氧化应激和自由基代谢的关系，探讨自由基对应激状态下机体机能的的影响，实现通过营养调控技术提高机体的抗氧化应激能力和动物机能的发挥。
方法：试验一：选用35只健康雄性KM小鼠作为研究对象，随机分为7个试验组，每组5只。安静对照组和游泳对照组饲喂基础日粮，其余5组分别饲喂在基础饲料中添加维生素C、维生素E、茶多酚、微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂的试验饲料。试验期间观察各组小鼠的生长情况；实验结束后，除安静对照组外，所有小鼠进行力竭游泳实验，记录力竭游泳时间；并计算小鼠脏器指数，测定小鼠血清中MDA、SOD含量和肝脏组织中NOS、CAT含量。
试验二：选择9窝23日龄仔猪，随机分为3组，每组3窝，对照组饲喂基础日粮，试验1组在基础饲粮中添加微生物源性抗氧化剂，试验2组在基础饲粮中添加复合抗氧化剂。试验期21天，仔猪在30日龄统一断奶。试验期间观察各组仔猪的生长及消耗饲料情况，计算增重和料重比。并分别在试验第1、8、15天，每组3只仔猪前腔静脉采血，分析血清中MDA、SOD、NO和GSH-Px含量。
结果：试验一：与安静对照组相比，力竭游泳会使小鼠血清中MDA含量升高22.86%，使血清SOD活力显著提高94.98%，肝脏中CAT活力升高12.74%，NOS活力显著提高27.90%；与游泳对照组相比，复合抗氧化剂能使小鼠血清中MDA含量显著降低37.66%，SOD活力显著提高20.44%，肝脏中CAT活力提高46.43%，NOS活力提高28.86%，且差异均显著(P<0.05)。复合抗氧化剂还能使小鼠力竭游泳时间显
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著提高199.26%(P<0.05)，复合抗氧化剂对小鼠体重及胸腺、脾脏指数有提高作用，但差异不显著(P>0.05)。
试验二：仔猪断奶1d和7d后血清中MDA含量分别比断奶前7d显著提高24.67%和16.51%(P<0.05)；仔猪断奶1d后血清中SOD、GSH-Px活力分别比断奶前7d提高2.87%和25.96%，NO含量显著提高32.19%；而断奶7d后血清中SOD、GSH-Px活力和NO含量分别比断奶后1d降低6.05%、15.86%、11.75%，并且分别比断奶前7d时低3.35%，高25.96%、高16.66%。与对照组相比，在饲料中添加复合抗氧化剂，能使断奶1d后仔猪血清中MDA下降6.77%，SOD、GSH-Px、NO分别升高11.61%、25.10%、19.55%；7d后仔猪血清中MDA含量下降7.32%，SOD、GSH-Px、NO分别升高11.76、25.10%、19.55%，且差异显著(P<0.05)。另外复合抗氧化剂有提高仔猪日增重和饲料报酬的趋势。
结论：氧化应激可以导致动物机体产生大量的自由基，脂质过氧化作用增强，机体受到损伤，抗疲劳能力和抗氧化能力下降。复合抗氧化剂由多种能清除机体自由基和提高机体抗疲劳，抗氧化能力的物质组成，各个成分之间又能发挥较好的协同增效作用，所以它拥有优于其他单一抗氧化剂的清除自由基的能力。通过给运动应激小鼠和断奶仔猪补充复合抗氧化剂，有明显的提高小鼠力竭游泳时间，降低小鼠和仔猪脂质过氧化损伤，提高小鼠和仔猪抗氧化酶发挥抗氧化能力的作用。实验证明，复合抗氧化剂能提高动物的抗氧化应激能力，促进动物机能的发挥。
关键词： 复合抗氧化剂，小鼠，仔猪，氧化应激，自由基代谢
II
EFFECTS OF COMPOSITE ANTIOXIDANTS ON
OXIDATIVE STRESS AND FREE RADICAL METABOLISM
IN ANIMALS
ABSTRACT
Objrctive: Oxidative stress is a common state in animal production, thereby seriously affecting the body's health and the performance of animal production. In this experiment the animals under oxidative stress was fed with composite antioxidant to study the influence of free radicals on the function of the body under stress state. To investigate the relationship among composite antioxidant, oxidative stress and free radical metabolism. And fianlly try to enhance the ability of anti-oxidative stress and animal functions play through nutritional regulation technology.
Methods: Experiment 1: Thirty-five healthy male KM mices were randomly divided into 7 group with 5 mouse in each group. Quiet control group and swimming control group was fed basal diet and the remaining five groups were fed the experient diet- basic diet fortified with vitamin C, vitamin E, polyphenols, microbial antioxidants and composite antioxidant individually. during the experient, the growth of mice in each group was observed. Exhaustive swimming time were determined at the end of the experiment in each group(except quiet control group).The the contents of serum MDA and activities of serum SOD, liver CAT, NOS was determined.
Experiment 2: 9 litters of 23-day-old piglets were randomly divided into three groups with 3 litters each. The control group was fed basal diet, test 1 fed basic diet- with micro-organisms derived antioxidants, the test 2 group fed basic diet added composite
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antioxidants. Trial period is 21 days, piglets weaned at 30 days old. During the test growth and feed consumption of each group were observed and recorded to calculate weight gain and feed conversion ratio. At the 1st, 8th, 15th day of Trial period, three piglets in each litter were selected to take blood from precava vein, the content of serum MDA, NO and activities of SOD, GSH-Px was analysed.
Results：Experiment 1: Compared with quiet control group, exhaustive swimming can noticeable decrease the contents of serum MDA by 22.86%, increase the activities of serum SOD by 94.98%, increase liver CAT, NOS activities by 12.74%,27.90%. Fed with composite antioxidants, mice can significantly extent exhaustive swimming time by 199.26% (P<0.05); crease the activities of serum SOD by 20.44% significantly (P<0.05) and remarkably decrease the contents of serum MDA by 37.66% (P<0.05) after exhaustive swimming. Similarly crease the activities of liver CAT by 46.43 significantly (P<0.05) and liver NOS by 28.86% (P<0.05) after exhaustive swimming.
Experiment 2: Compared with 7d prior to weaning, serum MDA levels in piglets at 1d and 7d post-weaning were increased by 24.67 and 16.51% (P<0.05); Serum SOD, GSH-Px activity and NO content at 1d post-weaning were increased by 2.87%, 25.96% and 32.19% compared with 7d pre-weaning; Serum SOD, GSH-Px activity and NO content at 7d post-weaning were increased by 6.05%, 15.86% and 11.75% compared with 1d post- weaning, lower 3.35% and higher 25.96% than 7d pre-weaning. Compared with the control group, added the complex anti-oxidants in feed, serum MDA in 1d post-weaning piglets can decreased by 6.77%, SOD, GSH-Px, NO were increased by 11.61%, 25.10%, 19.55%; 7d later serum MDA content decreased 7.32%, SOD, GSH-Px, NO were increased by 11.76, 25.10%, 19.55%, and is the significant difference (P<0.05). And composite antioxidant has the trend to improved piglet daily gain and feed conversion. Conclusion: The oxidative stress can cause animal body to produce a large number of free radicals, lipid peroxidation was increased, the body was injury, the ability of anti-fatigue and anti-oxidation were decreased. There are several active ingredients in composite antioxidant that can eliminate free radicals, improve the body's anti-fatigue, anti-oxidation ability, and also the various ingredients can achieve better synergies, so it`s better than other single antioxidants. Add composite antioxidants to the exercise stress mice and weaned piglets, can significantly increase the exhaustive time in swimming mice, reduced lipid peroxidation in mice and pigs, also can improve the capacity of antioxidant enzyme in mice and piglets. Experiments have showed that composite antioxidants can improve the ability of animals to against oxidative stress and promote animal functions.
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Keywords Composite antioxidate, Mice, Piglets, Oxidative stress, Free
radical metabolism
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目 录
摘 要...............................................................I 目 录.............................................................VI 第一章 前 言.......................................................1
1.1 自由基的概念....................................................................................................................1 1.2 自由基生物学的发展........................................................................................................1 1.3 自由基的种类....................................................................................................................2 1.4 自由基代谢........................................................................................................................3
1.4.1 自由基的产生..........................................................................................................3 1.4.2 自由基的清除..........................................................................................................4 1.5 氧化应激............................................................................................................................9
1.5.1应激及氧化应激.......................................................................................................9 1.5.2 疲劳态氧化应激....................................................................................................10 1.5.3 仔猪断奶时氧化应激............................................................................................10 1.6 研究目的、意义.............................................................................................................11
第二章 复合抗氧化剂对小鼠氧化应激及自由基代谢的影响..............13
2.1试验材料及方法...............................................................................................................13
2.1.1试验动物................................................................................................................13 2.1.2 试验材料...............................................................................................................13 2.1.3 试验药品...............................................................................................................14 2.1.4 实验仪器和设备....................................................................................................14 2.1.5实验动物分组及试验设计.....................................................................................14 2.1.6 样品采集...............................................................................................................16 2.1.7指标测定................................................................................................................16
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2.2 结 果..............................................................................................................................20
2.2.1小鼠体重变化情况.................................................................................................20 2.2.2小鼠脾脏、胸腺指数变化情况.............................................................................24 2.2.3小鼠游泳至力竭的时间变化情况.........................................................................25 2.2.4小鼠血清中MDA、SOD变化情况.....................................................................26 2.2.5小鼠肝脏中CAT、NOS变化情况......................................................................28 2.3 分析与讨论......................................................................................................................30
2.3.1关于运动及疲劳态氧化应激损伤.........................................................................30 2.3.2 几种单一抗氧化剂对自由基的清除效果............................................................31 2.3.3复合抗氧化剂的作用效果.....................................................................................32 2.4 小 结..............................................................................................................................33
第三章 复合抗氧化剂对仔猪断奶应激及自由基代谢的影响..............34
3.1材料与方法.......................................................................................................................35
3.1.1试验材料................................................................................................................35 3.1.2 实验药品...............................................................................................................35 3.1.3 实验仪器...............................................................................................................35 3.1.4试验动物与分组.....................................................................................................35 3.1.5 饲养管理...............................................................................................................35 3.1.6血样采集................................................................................................................36 3.1.7指标测定................................................................................................................37 3.1.8 数据处理与分析....................................................................................................40 3.2 结果..................................................................................................................................40
3.2.1 仔猪生产性能........................................................................................................40 3.2.2 仔猪血清MDA变化情况....................................................................................43 3.2.3 仔猪血清SOD变化情况.....................................................................................44 3.2.4 仔猪血清GSH-Px变化情况...............................................................................45 3.2.5 仔猪血清NO变化情况........................................................................................46
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3.3 分析与讨论......................................................................................................................47
3.3.1 断奶对仔猪氧化还原状况的影响........................................................................47 3.3.2 复合抗氧化剂对仔猪断奶应激的影响................................................................49 3.4 小 结..............................................................................................................................50
第四章 结 论......................................................51 参考文献...........................................................52 附 录..............................................................59 致 谢..............................................................60 攻读学位期间发表的学术论文目录.....................................61
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第一章 前 言
1.1 自由基的概念
自由基(Free radical)也称游离基，指外层轨道含有不对称电子的原子、原子团或分子。是由它们的化学性质不稳定，易与其他分子发生氧化反应而得名。生物体内自由基主要是半醌类自由基，氧自由基和其它碳、氮、硫中心自由基，其中，机体的自由基活力大部分来自氧自由基(OFR)，重要的氧自由基有超氧阴离子自由基(O2-·)、羟自由基(OH·)、质子化超氧阴离子自由基(HO2·)、脂氧自由基(LO·)和脂质过氧自由基(LOO·)等[1-3]。自由基的特点包括：在体内存在的时间短，化学性质极其活泼，极易和其他物质反应形成新的自由基，呈现明显的连锁反应。
1.2 自由基生物学的发展
自由基最早于1900年由Gomberg[4]发现。当时，Gomberg[4-6]在苯中用银与三苯卤甲烷反应制备六苯乙烷时，反应生成的产物是一种比六苯乙烷活泼的白色粉末，溶于苯中会变成黄色液体。该产物能在空气中快速氧化，并能立即与卤族元素反应。基于这种现象，Gomberg[7]假设这种复合物实际上是三苯甲基自由基：
Ph3CCl + Ag → Ph3C·+ AgCl
这个结论当时并不被化学家普遍接受。因为通过低温吸附证明，这个复合物具有和六苯乙烷相似的分子量。Gomberg继续通过在液体中的平衡解释这个现象
2PC3C·⇔Ph3C - CPh3.
白色固体被认为是六苯乙烷，溶解后的有色化合物被认为是自由基。而解释“六苯甲烷”与氧气和卤素的反应，从而清除自由基的反应为：
Ph3C·+ O2 → Ph3COO·
Ph3COO·+ Ph3C·→ Ph3COOCPh3
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Ph3C·+ X2 → Ph3CX+ X· Ph3C·+ X·→ Ph3CX
这之后越来越多支持Gomberg假说的证据开始产生。1923年，G.N.lewis[8]推论，所有包含奇数电子的复合物都应该具有顺磁性，研究Gomberg试验中的液体的磁性感受性发现，三苯甲基自由基确实存在，该反应解离的平衡常数也被测定出来。Gomberg之后的几年中，越来越多稳定的自由基被发现出来。1929年，制得了寿命更短的甲基自由基和乙基自由基，使自由基的存在得到进一步认可。到了1937年，M.S.Kharasch[9]第一次发现所谓“过氧化物效应”，解释了溴化氢和不对称烯烃“反-马尔柯夫”加成的原因，创立了化学领域的新分支—“新的有机化学”，即我们现在所谓的自由基化学。
自由基化学的发展启发了生物化学家们考虑生物体内是否存在自由基的问题。最早进入自由基生物学领域的是放射生物学。辐射诱发生物自由基造成放射病，为自由基生物学提供了最早和最直接的证据。1931年Michalis首次提出，某些酶促氧化还原反应的中间产物为自由基，他的学说及实验证据表明生物体内可能存在自由基。1956年，Harman[10]在分子生物学的基础上首先提出了自由基学说。1968年McCord和Fridovoh[11]发现了超氧化物歧化酶（SOD）及其重要的生物学作用，这是自由基生物学发展史上的一座里程碑，这之后新建的许多不需昂贵设备的普通生物化学测定自由基的方法，使自由基生物学得以迅猛发展。
自由基生物学的迅速和蓬勃发展，其理论及应用已经渗透到了包括农业科学在内的其他的生命学科中。动物科学作为农业科学的一个重要组成部分，其自由基生物学方面的研究也越来越多，并由最初的只集中在小鼠、大鼠等实验动物上，延伸到包括猪、鸡、牛等畜禽类生产动物身上。动物科学家们也正在不遗余力的应用自由基生物学知识解决着畜牧生产中的遇到的实际问题，目前也取得了一些成绩。
1.3 自由基的种类
生物体内的自由基按其化学结构有下列几种类型[12]：
① 半醌类自由基
苯醌与苯酚类化合物容易发生氧化还原反应，产生相对稳定的半醌自由基的
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中间产物。半醌类自由基广泛存在于许多生命过程之中，如黄素半醌自由基，再如辅酶Q10也是一种醌的衍生物，在呼吸链中辅酶Q10可以自由基的形式进行电子传递。
② 氧中心自由基
亦称为活性氧(reactive oxygen species, ROS)，包括超氧阴离子自由基(O2-·)、三线态氧(3O2) 和单线态氧和(1O2)、羟自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)、烷氧自由基(RO·)以及烷过氧自由基(ROO·)，有时还涉及酰氧自由基。NO自由基也可算作氧自由基，但也有人称之为活性氮(reactive nitrogen species, RNS)。
O2-·是体内主要的氧自由基，细胞中的一些膜性结构如线粒体、内质网、过氧化物体、细胞膜等都包含氧化酶系、电子传递酶系或过氧化氢酶系，这些酶系在催化其相应的底物过程中以不同的形式释放出自由基；3O2和1O2是氧分子中不成对电子占据不同轨道和不同自旋方向所形成的，它可以与不饱和脂肪酸反应生成脂质过氧化物；OH·带有一个不成对的电子，性质极活泼，其反应性和毒性都很强，对生物体的损害也最大，尤其是在金属离子存在时；H2O2是在各种氧化酶催化的反应过程中产生的，有些自由基代谢的中间产物也可以生成H2O2 ，H2O2很容易裂解产生OH·；NO是在精氨酸循环过程中产生的，动物体内许多细胞具有合成NO的能力。
③ 其他碳、氢、硫中心自由基
各种氨基酸、核苷酸的碱基以及其他生物大分子由于光、热等外源因素或内部因素会产生碳、氢、硫中心自由基。
1.4 自由基代谢
1.4.1 自由基的产生
自由基的产生包括外源性和内源性两种。
外源性主要是能进行氧化还原反应循环的醌类、硝基类等物质。此外，药物氧化、吸烟、电离、光照、热辐射冲击和氧化谷胱苷肽的物质、环境污染等外源性因素都能在细胞内形成自由基。
内源性：生物体内许多代谢过程中，都可自发地产生自由基。机体内自由基产生的主要途径[13]为：①在正常条件下，线粒体内的很少一部分分子氧，在细胞色素酶
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复合物的作用下，经1价还原而形成活化态氧(O2-·)，然后接受3个电子和3个氢离子，形成水和羟自由基(OH·)。②感染和毒素等因素激活补体而引发的反应催化分子氧发生单价还原，产生活化态氧(O2-·)，然后再生成羟自由基(OH·)。③机体内羟自由基的形成若超过机体的清除程度，羟自由基和机体蛋白质及其他成分结合并使之变性，此外还和细胞膜上的不饱和脂肪酸的不饱和双键结合，而生成脂质自由基(L·)，再和氧分子结合，形成脂质过氧基(LOO·)，脂质过氧基再和脂质(LH)结合，形成脂质自由基(L·)和氢脂质过氧化物(LOOH)，此为由羟自由基引起的一级引发反应，可以以链式反应不断进行下去。LOOH一旦形成，即可自发地发生均裂，产生另外的自由基碎片，即L·和O2H·（氢过氧基）或LO·和OH·或LOO·和H·，LO·和LOO·再引发脂质过氧化反应（二级引发反应），使反应不断进行下去。
1.4.2 自由基的清除 1.4.2.1 抗氧化酶系
机体抗氧化防御系统中的酶促系统包括：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，谷胱甘肽转移酶(GST)等。
① 超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase, SOD) 自从1968年McCord和Fridovich发现SOD及其催化超氧化物自由基歧化为O2与H2O以来，SOD一直被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。SOD是需氧生物和耐氧生物体内清除超氧化物的酶，属于金属酶，根据金属的差异，该酶分为Cu，Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种。Cu，Zn-SOD分子中有Cu，Zn两个不同的金属辅基，而且它们之间有一个组氨酸残基相连接，金属辅基是酶催化作用的关键部位，SOD以O2-·为底物，通过金属酶的活性部位中金属辅基交替氧化还原[14-20]，达到清除O2-·的目的。SOD的生物学作用包括：清除超氧化物自由基，防止对机体直接或间接的损伤；使O2-·成为细胞内自由基的排污槽；调节机体内O2-·的水平；调节机体内NO水平；催化反应产物H2O2的作用。
② 过氧化氢酶 (Catalase, CAT) 1811年，Thénard首先发现植物组织可以分解H2O2，产生O2。Schonberin认为该酶在反应中起到关键作用。1900年Oscar Loew[21]命名它为“Catalase”，并发现它存在由动物和植物中。后来Wolf与Stockklin[22]等相继提纯了这种酶，即过氧化氢酶。它的生理作用主要是可以催化H2O2转变为O2和H2O[23]。
③ 谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathione Peroxidase,简称GSH-Px) 于1957年被
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Mills[24]从牛红细胞中发现。GSH-Px的作用包括：清除脂质过氧化物；清除H2O2，减轻有机氢化物对机体的损伤；参与或调节前列腺素的生物合成[25,26]。
这些酶不但协同地防止活性氧的损伤效应，而且相互间还起着保护作用。O2-能灭活CAT和GSH-Px，而SOD能使O2-歧化生成H2O2，H2O2能灭活CuZn-SOD，而CAT和GSH-Px则能催化H2O2生成水和O2。SOD保护CAT和GSH-Px免受O2-灭活，同时CAT和GSH-Px保护CuZn-SOD不被H2O2灭活。因此，一旦在这相互保护系统中某一成员的减弱或减少，整个酶性保护系统就可能全线崩溃，导致不可逆性的细胞损伤[27,28]。
1.4.2.2 抗氧化剂
抗氧化剂是相对于氧化剂的名词。在自由基生物学中的抗氧化剂指化学与生物学上具有抗氧化作用的一类物质。在此意义上，抗氧化剂包括抗氧化酶、内源性非酶的抗氧化剂及外源抗氧化剂，在本部分中选出几种常见的外源性抗氧化剂进行介绍。
① 抗氧化维生素 有些维生素，如抗坏血酸、维生素E、β-胡萝卜素等，具有营养作用，又显示出突出的抗氧化作用，故常称为抗氧化维生素。
维生素C 又称抗坏血酸，在动物体液中，VC是一种非常重要的水溶性抗氧化剂，它在机体内自由基产生和清除的平衡过程中，起着重要作用。抗坏血酸体系的Michaelis两步氧化-还原过程是由抗坏血酸AH·介导的。
AH2 → AH·+ H· → A + 2H· 抗坏血酸 抗坏血酸自由基 脱氢抗坏血酸
抗坏血酸的还原性是它在氧化还原链中不断地被氧化成为脱氢抗坏血酸A，再还原成还原型AH2，使抗坏血酸不断的发挥抗氧化作用。Stocker和Frei[29]报道，VC是细胞外液中最重要的抗氧化物质，是细胞外液抗氧化系统的第1道屏障，它对血浆中正在进行着的脂质过氧化有阻断作用。VC可通过有效地抗活性氧自由基，减少组织中氧自由基，保护生物膜免遭过氧化物的损伤。维生素C作为由基清除剂，可以很快地与超氧阴离子自由基(O2-)和过氧化氢(H2O2)反应，更快地与羟自由基(OH·)反应生成抗坏血酸自由基，它也可以清除单线态氧(1O2)，从而保护机体免受内源性氧自由基的损伤。大量研究证明[30]，在家禽应激条件下，日粮中添加VC可有效地提高其抗应激能力。
维生素A 在营养学中，维生素A的活化形式包括视黄醇、视黄醛与视磺酸。
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早在1923年，Monagham与Schmidt[31]就观察到维生素A可抑制亚油酸的氧化。近几十年来，有较多的报告指出，维生素A具有抗氧化作用，如Samnkszyn等[32]报告，视磺酸能抑制肝微粒脂质过氧化。维生素A抑制脂质过氧化的方式不是清除引发脂质过氧化的自由基，而是作为反应链阻断的抗氧化剂，与有机过氧化自由基结合[33]
类胡萝卜素 类胡萝卜素是广泛分布于高等植物、藻类和其他原核生物的脂溶性色素。动物体内的类胡萝卜素是通过食物的摄取，转化后获得的。类胡萝卜素的抗氧化作用主要通过其分子中的8个或更多个双键，从1O2和激发态O2获得能量，并使
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O2与激发态O2淬灭为基态氧[34-36]。动物实验中β胡萝卜素有预防活性氧所致损伤的
作用，如Starkar[37]等指出，18周饲喂富含β胡萝卜素的膳食，可显著降低有致癌剂DEN一起的大鼠红细胞与肝细胞微粒体的酶反应多产生的脂质过氧化损伤。
维生素E类 维生素E是一种应用广泛的天然抗氧化剂，包括α-、β-、γ-、δ-生育酚与生育三烯酚。从VE的分子结构来看，因为它的苯环上有羟基(-OH)，对氧极其敏感，它随时都可抢先接受氧化，从而消除体内的OFR，使体内正常结构免遭氧化损害。VE为脂溶性物质，存在于细胞膜性结构中（细胞膜、线粒体、微粒体）以及脂肪细胞的脂滴和循环的脂蛋白中，其作用在于能与多种不饱和脂肪酸竟争脂质过氧基以终止脂质过氧化过程。维生素E还是单线态氧(1O2)和超氧阴离子自由基(O2-)的清除剂。因此，VE作为断链抗氧化剂，是体内抗氧化机制的第一道防线。张伟[38]研究表明，饲期日粮中添加高水平的VE对急性热应激过程中脂质过氧化产物MDA生成的减少和总抗氧化能力的提高有显著的改善作用。
② 微量元素 主要有硒、铜、锌、锰。硒是机体内氧自由基清除酶的必需成分，谷胱甘肽GSH保持其还原形式需要含硒酶的反应，硒与VE在保护细胞膜方面有协同作用。锌是 GSH-Px的重要组分，缺锌和锌过量都会引起脂质过氧化反应，含锌硫蛋白的合成亦需锌的诱导。铜、锌、锰这三种微量元素是机体内主要的抗氧化物酶SOD的必需成分。
③ 中草药抗氧化剂 我国学者应用近代生物医学理论与技术从多层次，多学科研究中医中药基本理论和制剂实质，取得了许多有应用价值的结果。中草药抗氧化机制包括清除氧自由基和羟自由基，抑制脂质过氧化反应，抑制生物膜不饱和脂肪酸过氧化反应，缓解氨基多糖的解聚作用等。这些中草药抗氧化剂的有效成分有黄酮类化合物、单宁类化合物、酚类化合物、皂苷类以及多糖类等，其他一些富含生物碱类、蒽醌类、木脂素类和毗咯烷酮类的一些中草药也有抗氧化作用。具有抗氧化作用的单味药有很多，如人参、西洋参、党参、太子参、黄芪、枸杞子、灵芝、三七、当归、
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五味子、何首乌、甘草、女贞子等。
④ 植物提取物类抗氧化剂 包括中国在内的许多国家，正在对植物提取物进行药理性的探索和研究，并已经取得显著的应用价值的成果。已经在欧美、日本等地广泛应用的欧洲蓝莓(VMA)、葡萄籽提取物(OPC)、松树皮提取物等植物提取物，又不完全等同于中草药抗氧化剂，因为植物提取物是植物中抗氧化成分精华的萃取，有些浓度可达90%以上，它们富含丰富的花青素、原花青素、黄酮类、酚类等，这使它们清除自由基、抗氧化的功效卓越而显著，是普通抗氧化剂抗氧化能力的几十倍。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是从茶叶中萃取出来的植物提取类抗氧化剂，包含表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸表没食子儿茶素。自20世纪50年代H.Roberts等对TP开展系统研究以来，TP的许多功能被陆续发现，近年来的大量研究证实，TP具有清除自由基[39]，防止脂质过氧化，抗氧化等生物活性。茶多酚是茶叶中的主要活性成分，TP结构中富含酚羟基，在抗氧化过程中可以提供多个活性氧。研究表明，TP可以显著提高热应激下肉仔鸡心脏和肝脏中总抗氧化酶的水平，并显著减低血清中MDA含量，提高肉仔鸡的抗氧化能力[40]。
⑤ 微生物源性抗氧化剂 利用微生物发酵产生多种具有清除自由基功能的抗氧化剂，也是目前研究的热点。单一的微生物，如德氏保加利亚乳菌亚种2038[41], 发酵乳杆菌[42]等，本身就是有效地抗氧化剂。另外，一些物质通过微生物的发酵作用，也会提高它们的抗氧化能力。例如，晒青毛茶经过微生物发酵制成的普洱茶[43]，地衣芽枯草杆菌C2-13发酵的红花[44]都具有了更好的抗氧化性能力。用枯草芽孢杆菌发酵的广昌白莲发酵液[45]也有较高的清除羟自由基的活性。本试验所用的由光合菌和酵母菌等发酵生产，含有维生素、槲皮酮（类黄酮）、肌醇和多种微量元素的金属衍生物。本课题组通过现有的研究发现，该种微生物源性抗氧化剂在一定程度上可以提高动物的抗氧化能力，增强其生产及繁殖性能。
1.4.2.3 多种抗氧化剂的复合应用
自然界的自由基清除剂或抗氧化剂达数百种之多，不同的自由基清除剂或抗氧化剂具有不同的理化性质，作用特点。直到目前为止，还没有一种纯天然或人工合成的抗氧化剂可以代替或高于所有其他的抗氧化剂，如茶多酚的抗氧化效能是很高的，但是它和所有的天然抗氧化剂一样，也存在在某些情况下出现促氧化或很大剂量使用时可能出现细胞毒性等问题。于是，专家们开始转向研究将单一抗氧化剂复合使用来寻求解决这一问题的办法。
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抗氧化剂间普遍存在协同作用。1962年，Tappel率先开展了VE与VC间协同作用的研究并提出了VC再生VE的观点。随后的一些研究证实了这个结论，Niki[46]通过研究豆卵磷脂水分散体系中VE和VC的协同抗氧化作用发现，反应初期VE的浓度基本不变而VC浓度不断降低, 当VC消耗完后，VE的浓度开始下降[47]。随后人们又发现VE与β-胡萝卜素[48
，49，50]
之间、VE与茶多酚之间[51]、茶多酚与类胡萝卜素
之间[52]，VC、VE与茶多酚之间都存在协同增效作用。利用不同抗氧化剂之间的协同增效作用有利于避免使用单一抗氧化剂负荷过重所造成的伤害，且单一抗氧化剂不能全面提高机体的抗氧化能力，多抗氧化剂复合使用则可全面提高机体的抗氧化能力。
近些年来，基于自由基连锁反应特性及抗氧化剂复合体系的联合增效，国内外专家分别提出了“抗氧化复合链”和“抗氧化网络”等概念，已逐渐成为抗氧化剂复合应用研究的一个热点。
海春旭在90年针对当时国内外抗氧化研究状况提出了“抗氧化复合链(Multiantioxidants chain)”假说[53]，其主要内涵为：体内脂质过氧化、自由基是链式反应，自由基存在多态性特点；机体自身和外源补充抗氧化剂之间存在相互拮抗、替代、补充和协同作用；采用不同活性强度、不同作用对象、不同脂水溶解性、不同存在部位的抗氧化剂有机组合、形成抗氧化剂复合链，可发挥整体有效的抗氧化作用。
前自由基研究会主席Lester Packer[54]博士提出了“抗氧化网络(antioxidants network)”，主要指重要的抗氧化剂之间存在着一种动态的相互作用，并称这些相互影响的化学物为“网络抗氧化剂(network antioxidant)”。该理论认为，一般的抗氧化剂只能发挥一次作用，而网络抗氧化剂不同，当其他抗氧化剂单独工作时，网络抗氧化剂成员一起工作，形成机体抵御自由基损伤的核心力量，并形成循环系统。网络抗氧化剂中各组分的共同特点就是可将自身以外的至少一种抗氧化剂还原再生，使其重新拥有抗氧化能力。在体内，网络抗氧化剂再生循环瞬间可发生无数次，但它们在细胞内同时发挥着各自独特的保护功能。Lester提出的网络抗氧化剂由五种抗氧化剂组成，它们包括：维生素C、维生素E、谷胱甘肽、硫辛酸、辅酶Q10(CoQ10)。
由此可见，通过将某些的单一抗氧化物质复合使用，各个抗氧化物质之间可以相互协同，相互保护，从而构成一个环，永远持续的进行抗氧化作用。如何找到这种复合抗氧化剂的组合，对整个自由基研究领域的学者来说都是一种诱惑。值得庆幸的是Lester教授已经首先找到了一组网络抗氧化剂。相信随着各专家学者的辛勤的研究工作，还将会出现更加有效地组合。所以说，抗氧化剂的研究前景是非常广阔的。
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1.5 氧化应激
1.5.1应激及氧化应激
应激一词最早自英文“stress”，意为“紧迫、逆境反应、压力、应力”。加拿大生理学家Selye[55]首先提出应激这一概念。他认为，应激是指动物在外界和内在环境中，一些具有损伤性的生物、物理、化学，以及特种心理上强烈刺激作用于机体后，随即产生的一系列非特异性全身反应，或者说是非特异性反应的总和。应激反应也可以定义为一种由环境引起的内部平衡的紊乱，所谓平衡则意味着动物体内所有机体细胞保持一定程度的稳定，为了在上述各种应激条件下保持这种平衡，机体需要调动各种调节机制。
氧化应激的概念最早源于人类对衰老的认识。1956年英国学者Harman[56]首次提出自由基衰老学说，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。1990年美国衰老研究权威Sohal[57]教授指出了自由基衰老学说的种种缺陷，并首先提出了氧化应激的概念。
氧化应激(Oxidative stress)是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基( RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。活性氧造成的氧化损伤称之为氧化应激态。致使机体处于氧化应激态的因素可以归结为以下三方面[58]：产生过量的氧自由基；机体细胞内生化“分隔”状态的破坏，使大量金属离子和酶泄露出来，启动和促进脂质过氧化；机体抗氧化体系的减弱。氧化应激水平的升高，会破坏机体自稳态，结果导致疾病的产生。
随着我国畜牧业特别是现代养殖业的集约化程度提高，及人们对动物保健意识的增强，动物应激医学也成为动物医学的重要组成部分，动物应激医学十分注重在热、冷、断奶、运输等特殊应激源暴露下的动物应激反应。应激对动物机体各系统有着广泛的影响，包括物质和能量代谢的改变、神经内分泌的改变、动物免疫机能的改变等，并常伴有组织器官的病理性损伤[59]。
在现代畜禽养殖业中，越来越多的原以为已经控制住的疾病，如猪瘟、大肠杆菌病、禽流感、疯牛病、口蹄疫等的免疫失败，动物莫名高热病、母畜流产和畜禽莫名死亡等严重威胁着养殖业的发展。据资料报道[60]，畜禽疾病每年给全世界畜禽生产造成的经济损失，在发达国家占年交易额的17%，在发展中国家高达35%～50%。为
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了控制这些疾病，大量的药物和疫苗的使用不但增加了畜禽产品的药物残留和危害消费者健康的可能性，而且使得病原微生物变异加快，增加了疾病控制的难度。这就给动物应激学研究提出了很大的挑战。在动物应激医学研究中，畜禽氧化应激已成为当前研究的热点和重点。
许多因素可诱导畜禽产生氧化应激：如日粮中多不饱和脂肪酸含量过高；矿物元素硒、铜、锌或锰缺乏等；环境因素，如冷、热、缺氧等的影响时，机体氧自由基过量生成和/或细胞内抗氧化防御系统受损，都可产生氧化应激。在畜禽氧化应激状态下，细胞内产生大量的OFR，OFR破坏生物膜，影响细胞正常功能，影响DNA、RNA热稳定性，影响酶的活性，加速蛋白质分解。动物表现为生产性能下降，或发生应激性综合症。长期应激会导致机体内具有抗氧化能力的维生素和微量元素等的消耗，自由基进一步增加，免疫系统发育受阻，免疫力的发挥受限，畜禽抵抗疾病的能力下降，从而诱发一系列的疾病和死亡。
1.5.2 疲劳态氧化应激
运动性氧化还原应激是指在运动过程中，随着运动时间和强度的不断增加，内源性的活性氧在体内大量的积累，当浓度超出了机体的抗氧化防护能力时，就产生了运动性氧化还原应激现象，运动性氧化应激会导致机体的疲劳状态及损伤。
运动性氧化还原应激的危害主要是由于活性氧和脂质过氧化物的过量生成。1978 年Dillard[61]就提出了运动性氧化应激导致组织损伤的自由基理论。此后，人们开始探讨运动、氧化应激损伤和机体抗氧化能力之间的相互关系。力竭性运动会诱发哺乳动物心肌、骨骼肌、肝脏等组织线粒体产生较多活性氧，机体抗氧化酶活性下降，自由基生成与清除失去平衡，致使机体自由基和脂质过氧化水平提高，从而导致脂质、蛋白质等的氧化损伤，其中氧自由基系统与运动之间的关系最为密切[62]，可导致运动性疲劳及运动损伤[63]。
近年来，许多学者研究证实，运动性氧化应激和营养均与自由基的反应有关。于是通过营养手段研究新型高效自由基清除剂就成为减缓运动氧化应激损伤，提高机体抗疲劳能力的关键。
1.5.3 仔猪断奶时氧化应激
断奶，是猪出生后面临的最大的应激。在传统的养猪生产中，仔猪常在45-60日龄断奶。现代化养猪生产为提高母猪的年生产力，常通过早期断奶技术，将断奶日龄
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缩短到21-28日龄，以缩短母猪的哺乳期，这样不仅可以增加母猪年产胎次，提高母猪生产能力和栏舍利用率，同时可以及早弥补仔猪的营养需要，防止母猪压死仔猪和减少仔猪感染传染病和寄生虫病的机会，有利于提高仔猪成活率，节约公母猪的饲养成本，有利于提高猪场的综合效益。但其不利的一方面也显而易见，那就是过早的断奶会导致仔猪更容易产生强烈的氧化应激反应。
仔猪断奶后离开母体并由产房转入保育舍，与不同窝的仔猪混群饲养，导致仔猪所处环境发生变化，此变化对仔猪的心理会造成很大的恐惧。日粮也由液态的母乳变成不同质的固体饲料，上述环境、心理、日粮的变化共同构成仔猪的应激源。动物受到强烈的应激源刺激后，通过神经内分泌和紊乱的代谢调节，力图使机体的生命活动恢复到一个新的相对稳定的正常功能状态即所谓“一般适应综合症”。
但是由于此时仔猪消化系统和免疫组织发育不完善，所以断奶后会出现食欲减退，消化功能紊乱、抗病力差、腹泻和行为异常（如恐惧焦躁、嗅味、咬尾）甚至死亡等一系列的应激症状，而且与生产性能和后期生产性状密切相关的骨骼肌也会发生一些退行性变化，最终表现为生长抑制。特别是腹泻比较普遍，轻度腹泻会导致仔猪营养不良及生长抑制，严重腹泻则导致仔猪脱水，甚至死亡。我们通常将这些由仔猪早期断奶引起的仔猪疾病称为仔猪早期断奶应激综合症，主要包括非传统性腹泻(NID)、断奶后休克样综合症(WDS)、水肿病综合症(ODS)、断奶后僵猪综合症(WPS)、断奶后休克样综合症(WSS)、断奶后咬尾咬耳综合症(TB-ECS)等六种[64]。
由此可见，断奶不仅会产生严重的营养性后果，还会影响到仔猪的神经内分泌系统，免疫状态和行为状态。仔猪出生后快速生长、生理急剧变化，对养分的需要高。但是仔猪消化系统和免疫系统发育都还不完善，断奶后营养源从母乳转向固体饲料，再加之与母猪分离等，诸多因素可引起仔猪产生氧化应激。在氧化应激状况下，仔猪体内自由基稳衡性动态异常，将会发生自由基的损伤，若不能及时修复，则会诱发疾病或引起死亡。自由基稳衡性动态的物质基础是营养物质及其代谢物，因此，在仔猪的饲料中除了其必需成分的供给量满足营养需要外，还要求其效果可以保证动物体内自由基稳衡性动态维持正常，并且还要求能保持营养物质及其代谢与自由基稳衡性动态的密切关系。能否通过营养调控的手段，既增强仔猪的免疫机能和抗病能力，又缓解氧化应激引起的生长抑制，受到越来越多学者的关注。
1.6 研究目的、意义
目前，很过生物学和医学领域的专家学者非常关注自由基代谢、氧化应激和新型
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高效抗氧剂的研究，但在畜牧生产领域的研究还相对较少。
在本试验中，先是通过小鼠疲劳态氧化应激模型，评价几种抗氧化剂对清除自由基，提高动物机体抗氧化能力的效果。然后将优选得到的复合抗氧化剂，添加到仔猪断奶日粮中，研究其对调控仔猪断奶应激和促进仔猪生产机能发挥的能力。本研究的创新之处在于：从畜牧生产实际出发，研究仔猪断奶前后自由基及抗氧化酶系统的发育状况；研制出一种能提高仔猪抗断奶应激能力的复合抗氧化剂，系统研究复合抗氧化剂对仔猪抗氧化酶活性的影响，进一步阐述了复合抗氧化剂对仔猪自由基及抗氧化应激的作用及其机理。
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第二章 复合抗氧化剂对小鼠氧化应激及自由基
代谢的影响
自由基是机体组织内许多生化反应的中间代谢产物，机体在正常生理状态时，一定量的自由基对维持机体组织功能是必需的，但当机体在遭受各种有害刺激时，体内自由基（如活性氧自由基）会大量产生，自由基的产生超过机体的清除的能力，氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤[65,66]，即为氧化应激。在力竭运动过程中，随着运动时间和强度不断增加，内源性的活性氧在体内大量积累，当浓度超出了机体的抗氧化防护能力时，就产生了疲劳态氧化应激现象[67-69]。疲劳态氧化应激会导致包括肌肉、肝脏、心脏和肺等组织的氧化损伤，从而造成机体的疲劳和疾病[70-73]。
随着自由基生命科学的发展，寻找高效的抗氧化剂，清除体内多余的自由基，减缓氧化应激造成的疲劳及损伤，已成为营养学领域的研究热点。抗氧化剂是一些能够稳定体内自由基的物质，它能抑制由自由基导致的机体连锁氧化反应。在本部分实验中，我们着重研究复合抗氧化剂对小鼠疲劳态氧化应激和自由基代谢的影响。复合抗氧化剂是由维生素C、维生素E、茶多酚、微生物抗氧化剂这几种单一抗氧化剂以一具有很好抗氧化，定比例复合而成的。这几种单一抗氧化成分都是已经被证明的[74-77]，清除自由基能力的抗氧化剂。我们希望通过将单一抗氧化剂复合使用，使各组分间发挥很好的协同作用，最终起到优于单独使用其中任意一种抗氧化剂的抗氧化效果。
2.1试验材料及方法
2.1.1试验动物
试验选用48只雄性KM小鼠，清洁级，购自上海斯莱克生物科技有限公司。 2.1.2 试验材料
维生素C：含量92%，上海富郎特动物保健品有限公司提供； 维生素E：含量50%，上海富郎特动物保健品有限公司提供；
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茶多酚：含量20%，上海三维饲料添加剂有限公司提供； 微生物源性添加剂：上海创博生态工程有限公司提供； 基础日粮：购于上海斯莱克生物科技有限公司； 2.1.3 试验药品
氯化钠（NaCl）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司 乙酸：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司 无水乙醇：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司
微量丙二醛（MDA）检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。
超氧化物歧化酶（SOD）活力检测试剂盒：试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 过氧化氢酶（CAT）活力检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。 一氧化氮合酶（NOS）活力检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。 2.1.4 实验仪器和设备 电子分析天平：ACCULAB
电子天平：上海良华仪器有限公司，型号：MP2000 紫外光栅分光光度计：上海精密仪器，型号：752 高速离心机：德国Eppendorf公司，型号Centrifuge 5804R 实验室级超纯化水器：上海摩勒科学仪器 数显鼓风干燥箱灭菌箱：上海博讯实业有限公司 立式蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司
电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司，型号DK-S24 超声波清洗器：上海波龙电子电子设备有限公司，型号USC-502 超低温冰箱：Thermo Forma
漩涡搅拌器：广州IKA公司，型号MS1 Minishaker 2.1.5实验动物分组及试验设计
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2.1.5.1 动物分组及饲养
试验选用35只雄性KM小鼠（购自上海斯莱克生物科技有限公司，清洁级），随机分成7组，每组各5只。安静对照组组和游泳对照组饲喂基础饲粮，维生素C组、维生素E组、茶多酚组、微生物抗氧化剂组和复合抗氧化剂组分别在基础日粮中添加1 g/kg VC、400 mg /kgVE、1.5 g/kg TP、20 g/kg 微生物源性添加剂和5.75 g/kg复合抗氧化剂（每kg复合抗氧化剂含有200 mg VC、100 mg VE、450 mg TP和5 g 微生物抗氧化剂）。
所有动物均饲养于上海交通大学农业与生物学院动物房中，室温28℃～32℃，相对湿度50%～60%，光照明暗各12 h，任意采食，自由饮水。
表2-1 基础饲料营养成分表
Table 2-1 Compositions and Nutrient level in basical diet 营养指标 Nutrients 水分（％） 粗蛋白（％） 粗脂肪（％） 粗灰分（％） 粗纤维（％） 无氮浸出物（％）
钙（％） 磷（％）
含量 Contents
9.7 20.5 4.62 6.2 4.35 52.5 1.23 0.91
钙：磷 1.35：1 赖氨酸（％） 蛋氨酸+胱氨酸（％）
1.3 0.68
2.1.5.2 试验设计
预饲期2周，正试期3个月。在实验期第1，15，45，90日分别对每只小鼠称重。正试期第90 d，除安静对照组外，所有实验小鼠分别在水温25±1 ℃，长宽高48 cm×48 cm×58 cm的塑料桶中做无负重的力竭游泳实验。力竭标准为小鼠下沉后10 s
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不露出水面[78]。实验结束后，游泳结束后，迅速取出小鼠擦干，乙醚麻醉，即刻对小鼠进行摘眼球取血。取血后，断头处死小鼠，取出肝脏、脾脏、胸腺，以待进行各项指标的检测。
2.1.6 样品采集 2.1.6.1 血清的制备：
摘眼球取出的血液样本，在室温中静置1个小时，待血清析出后，在高速离心机中，4℃，3000rpm离心15min。弃沉淀，保留上清液。血清用于测定MDA、SOD等指标。
2.1.6.2 肝组织匀浆的制备：
取肝组织0.5g在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重放入小烧杯中。用移液管量取9倍于肝组织重量的预冷的生理盐水，眼科剪剪碎，匀浆管中充分研碎，使组织匀浆化，制备成10%的组织匀浆。将匀浆用离心机2000r/min离心15 min，将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。上清液用于测定CAT、NOS等指标。
2.1.7指标测定
2.1.7.1生长性能有关指标 （1）体重指标
（2）脾脏、胸腺指标测定
① 脾脏、胸腺器官重量：取各组小鼠的脾脏和胸腺组织，以0.9%预冷生理盐水洗去血迹，滤纸拭干后，电子分析天平上称重。
② 脾脏、胸腺系数计算：胸腺（脾脏）系数=胸腺（脾脏）重量（mg）/体重（g） 2.1.7.2抗氧化指标测定
（1） 血清中微量MDA含量的检测方法
① 测定方法：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532m处有最大吸收峰。
② 加样流程：
试剂
标准管
标准空白管
测定管
测定空白管
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10 nmol/ml 标准品 (ml) 无水乙醇 测试样品 试剂一
混匀（摇动几下试管架） 试剂二（ml） 试剂三（ml） 50% 冰醋酸
0.1 -- -- -- -- 0.1 -- -- -- -- 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
3 3 3 3 1 1 1 -- -- -- -- 1
漩涡混匀器混匀，置95℃水浴40分钟，取出样品后流水冷却，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
③ 计算公式：
血清中MDA含量(nmol/ml)=
测定管吸光度−测定空白管吸光度
×标准管浓度(10nmol/ml)
标准管吸光度−标准空白管吸光度（2）血清中SOD活力的检测方法 ① 测定原理：
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2-·），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
② 加样流程
试剂
试剂一（ml） 样品（ml） 蒸馏水（ml） 试剂二（ml）
测定管
对照管
1.0 1.0 0.005 -- -- 0.005 0.1 0.1
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试剂三（ml） 试剂四（ml）
0.1 0.1 0.1 0.1
用漩涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟
显色剂（ml） 2 2
混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。
③ 计算公式：
总SOD活力(U/ml)=
(对照管吸光度−测定管吸光度)
÷50%×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数
对照管吸光度
（3）肝脏组织匀浆中蛋白含量的测定 ① 测定原理
蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算蛋白含量。
② 加样流程
蒸馏水（ml） 0.563g/L标准液（ml） 1%肝组织匀浆（ml） 考马斯亮兰显色剂（ml）
空白管
标准管
测定管
0.05 -- -- -- 0.05 -- -- -- 0.05 3.0 3.0 3.0
混匀，静置10分钟，于595nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管OD值。 ③ 计算公式： 蛋白含量（g/L）=
测定管OD值−空白管OD值
×标准管浓度（g/L）
标准管OD值−空白管OD值
（4）肝脏中CAT活力的检测
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① 测定原理：
剩余的H2O2过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，可计算出CAT的活力。
② 加样流程
试剂
组织匀浆（ml）
试剂一（37℃预热）（ml） 试剂二（37℃预热）（ml）
对照管
测定管
-- 0.05 1.0 1.0 0.1 0.1
混匀，置37℃恒温水浴准确反映1分钟
试剂三（ml） 试剂四（ml） 组织匀浆（ml）
1.0 1.0 0.1 0.1 0.05 --
混匀，0.5cm光径，波长405nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度。 ③ 计算公式：
组织匀浆中CAT活力（U/mgprot）=（对照管OD值−测定管OD值）×271÷（4）肝脏中NOS活力的检测 ① 测定原理：
NOS催化L-Arg和分子氧生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530 nm波长下测定吸光度，根据吸光度计算出NOS活力。
② 加样流程
试剂 双蒸水 (μl) 样本 (μl)
空白管
总NOS测定管
1
÷匀浆蛋白含量（mgprot/ml）
60×取样量
30 -- -- 30
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试剂一底物缓冲液 (μl) 试剂二 促进剂 (μl) 试剂三 显色剂 (μl)
200 200 10 10 100 100
混匀，37℃水浴准确反映15分钟
试剂四 透明剂 (μl) 试剂五 终止剂 (μl)
100 100 2000 2000
混匀，530 nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。 ③ 计算公式：
总NOS活力（U/mgprot）=×
总NOS测定管OD值−空白管OD值反应液总体积
×
呈色物纳摩尔消光系数取样量
1
÷蛋白含量（mgprot/L）
比色光径×反应时间
2.1.8 数据处理与分析
用Excel 2003和SAS 9.1.3统计分析软件对数据进行处理，用ANOVA程序进行单因素方差分析，DUNCAN法进行组间多重比较，显著性水平为P＜0.05。全部实验数据均采用平均数±标准差(X±SD)表示。
2.2 结 果
2.2.1小鼠体重变化情况
由表2-2，图2-1、2可知，各组在实验开始时体重均不存在显著差异；在实验结束时，与游泳对照组相比，各种抗氧化剂组均能使小鼠的体重有所增加，维生素C，维生素E，茶多酚，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠的增重提高2.92%，11.75%，5.40%，8.66%，15.85%，其中复合抗氧化剂对小鼠增重提高的效果最明显，但各组间体重差异并不显著(P>0.05)。从增重来看，实验第1-15d，对照组和TP组的增重显著低于其他各组(P<0.05)；实验第15-45d，各组间增重差异不显著；总结实验1-45d的增重，可以看出，复合组的增重显著高于实验对照组和TP组；第45-90d，微生物组的增重又显著升高，不过从1-90d全期增重来看，各组间并无显著差异
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(P>0.05)。
表2-2 不同抗氧化剂对小鼠体重的影响
Table 2-2 Effects of different antioxidants on body weight in mice
游泳对照组 VC组 VE组 TP组 第1日体重
35.46±2.7786 35.61±1.7823 33.58±1.5593 34.57±1.4494 35.06±2.0958 34.01±2.6160 第15日体重
40.26±2.8326 43.13±2.5341a 41.14±2.5220 40.23±1.2038 42.82±1.9939 41.95±2.6084 第45日体重
47.55±3.9242 49.79±3.6275 48.25±4.2465 46.75±3.0068 47.76±2.4425 49.32±4.9572 第90日体重
53.25±4.6463 53.92±3.1557 53.44±2.7717 52.91±2.3954 54.39±2.5465 54.63±6.8717 实验第1-15日增重
4.80±0.9567b 7.53±0.9486a 7.56±1.5284a 5.66±0.3127b 7.76±1.1214a 7.94±0.9654a 实验第15-45日增重
7.29±1.1720 6.66±1.3383 7.11±1.9195 6.52±2.0150 4.94±0.5560 7.36±2.5436 实验第1-45日增重
12.09±1.5577b 14.18±2.0106ab 14.67±2. 7824ab实验第45-90d增重
5.71±0.8057ab 4.13±0.7497b 5.19±1.9187ab 6.16±1.4757ab 6.63±1.0431a 5.31±2.6522ab 实验第1-90日
17.80±2.2374 18.31±1.4331 19.86±1.2681 18.34±0.9567 19.33±0.5542 20.61±4.4916 注：字母不相同表示差异显著（P<0.05），下同。The data within a column followed by the same letter are not significantly different at 5 % level, the same in the following tables.
12.18±1.8546b 12.70±1.1310ab 15.30±2.3945a
微生物组
复合组
第21页
5752Body Weight(kg)游泳对照组47微生物C维生素E茶多酚微生物复合423732020406080100
试验天数(d)图 2-1 不同抗氧化剂对小鼠体重的影响
Fig.2-1 The effcts of different antioxidants on body weight in mice.
第22页
1210Weight Gain(g)86420实验第1-15日增重实验第15-45日增重实验第45-90日增重
图 2-2 不同抗氧化剂对小鼠增重的影响
Fig.2-2 The effcts of different antioxidants on body gain in mice.
游泳对照组微生物C维生素E茶多酚微生物复合
第23页
2.2.2小鼠脾脏、胸腺指数变化情况
从表2-3和图2-3中我们可以看出，各种抗氧化剂对小鼠的脾脏和胸腺指数增加都有一定作用。与游泳对照组相比，VC，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠脾脏指数增加3.80%，4.77%，28.99%，0.87%，7.12%；使小鼠胸腺指数增加6.43%，8.65%，2.30%，17.35%，10.20%，但并无统计学意义(P>0.05)。
表2-3 不同抗氧化剂对小鼠脾脏及胸腺指数的影响
Table 2-3 Effects of different antioxidants on Spleen and Thymus index in mice
安静对照组 游泳对照组 VC组 VE组 TP组 微生物组 复合组
脾脏指数 (mg/g)
胸腺指数 (mg/g)
2.5022±0.3314 0.9759±0.2475 2.6157±0.4337 0.9546±0.2289 2.7152±0.4472 1.0160±0.2367 2.7405±0.7505 1.0372±0.1466 3.3741±0.8761 0.9766±0. 0585 2.6385±0.7035 1.1202±0.1384 2.8020±0.3562 1.0520±0.2069
4.543.532.521.510.50Spleen index (mg/g）Thymus index (mg/g)
图2-3 不同抗氧化剂对小鼠脾脏及胸腺指数的影响
Fig.2-3 Effects of different antioxidants on Spleen and Thymus index in mice
安静对照组游泳对照组VC组VE组TP组微生物组复合组第24页
2.2.3小鼠游泳至力竭的时间变化情况
由表2-4和图2-4可见，各种抗氧化剂均能提高小鼠力竭游泳时间，与游泳对照组相比，VC，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠力竭游泳时间延长38.94%， 119.58%，55.05%，97.41%，199.26%。其中，除VC外，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂均能显著延长小鼠力竭游泳时间(P<0.05)，提高小鼠的抗疲劳能力，而复合抗氧化剂延长小鼠力竭游泳时间的效果最显著。
表2-4 不同抗氧化剂对小鼠游泳至力竭的时间的影响
Table 2-4 Effects of different antioxidants on exhaustive swimming time in mice
游泳时间 (min)
游泳对照组 51.39±9.99e VC组 71.40±13.96de VE组 112.84±18.45b TP组 79.68±20.12cd 微生物组 101.45±17.16bc 复合组 153.79±24.65a
200180160140120100806040200Exhaustive swimming time(min)游泳对照组VC组VE组茶多酚组微生物组复合组
图 2-4 不同抗氧化剂对小鼠游泳至力竭时间的影响
Fig.2-4 Effects of different antioxidants on exhaustive swimming time in mice
第25页
2.2.4小鼠血清中MDA、SOD变化情况
由表2-5和图2-5，2-6可见，与安静对照组相比，游泳对照组中的小鼠经过力竭游泳后，其血清中MDA含量升高22.86%，SOD活力显著提高94.98%(P<0.05)。与游泳对照组相比，在基础饲料中添加VC，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠血清中的MDA降低20.78%，36.13%，30.93%，29.71，37.66%；其中VE、TP、微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂降低力竭游泳后血清MDA含量的效果显著(P<0.05)，并且复合抗氧化剂减低小鼠力竭游泳后血清中MDA的能力最显著。另外，各种抗氧化剂对提高血清中SOD活力提高小鼠抗氧化能力也都有一定的效果，且VC，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠血清中的SOD活力升高1.22%，2.54%，9.15%，19.61%，20.44%，其中微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂对于提高游泳后小鼠血清中SOD活力的效果显著(P<0.05)，并且复合抗氧化剂对提高小鼠游泳力竭后血清中SOD活力的效果最显著。
表2-5 不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中MDA和SOD活性的影响 Table 2-5 Effects of different antioxidants on mice`s serum MDA, SOD concentration after
exhaustive swiming
血清MDA (nmol/ml)
血清SOD (U/ml)
安静对照组 3.5714±0.1000 a 133.0813±28.2405c 游泳对照组 4.3880±1.1352a 259.4764±22.3177b VC组 3.4760±1.2134ab 262.6512±22.4819b VE组 2.8028±0.7592b 266.0668±28.3890b TP组 3.0310±0.7829b 283.2196±19.9746ab 微生物组 3.0845±0.5685b 310.3716±23.3305a 复合组 2.7355±0.7148b 312.5152±24.3322a
第26页
6543210serum MDA concentration(nmol/ml)
图 2-5 不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中MDA含量的影响
Fig.2-5 Effects of different antioxidants on mice`s serum MDA concentration after exhaustive
swiming
安静对照组游泳对照组VC组VE组茶多酚组TP组复合抗组400350300250200150100500serum SOD activity (U/ml)
图 2-6 不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠血清中SOD活性的影响
Fig.2-6 Effects of different antioxidants on mice`s serum SOD activity after exhaustive swiming
安静对照组游泳对照组VC组VE组茶多酚组微生物组复合抗组
第27页
2.2.5小鼠肝脏中CAT、NOS变化情况
由表2-6和图2-7，2-8可见，与安静对照组相比，游泳对照组中的小鼠经过力竭游泳后，其肝脏中CAT活力升高12.74%，NOS活力显著提高27.90%(P<0.05)。与游泳对照组相比，在基础饲料中添加VC，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠肝脏中的CAT活力升高2.66%，43.00%，45.62%，55.97，46.43%；其中VE、TP、微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂使小鼠力竭游泳后肝脏CAT含量升高的效果显著(P<0.05)。另外，与游泳对照组相比，各种抗氧化剂对提高力竭游泳后小鼠肝脏中NOS活力也都有一定效果，VC，VE，TP，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使小鼠血清中的NOS活力升高28.70%，29.34%，14.08%，15.52%，28.86%，其中VC和VE、复合抗氧化剂对于提高游泳后小鼠肝脏中NOS活力的效果显著(P<0.05)，但与TP、微生物抗氧化剂的作用效果之间差异不显著(P>0.05)。
表2-6 不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠肝脏中CAT和NOS活性的影响
Table 2-6 Effects of different antioxidants on mice’s liver CAT, NOS concentration after exhaustive
swiming
肝脏CAT (U/mgprot)
肝脏NOS (U/mgprot)
安静对照组 27.7997±1.4960a 13.9713±2.6928c 游泳对照组 31.3419±6.9593a 17.8697±2.1743b VC组 32.1770±4.0582a 22.9976±2.3231a VE组 44.8185±7.3581b 23.1121±2.5393a TP组 45.6387±3.0758b 20.3859±2.1134ab 微生物组 48.8834±4.7628b 20.6424±3.4052ab 复合组 45.8926±13.4456b 23.0268±3.5898a
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7060CAT(U/mgprot)50403020100肝脏CAT (U/mgprot)
图2-7 不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠肝脏中CAT活性的影响
Fig.2-7 Effects of different antioxidants on mice`s liver CAT activities after exhaustive swiming
安静对照组游泳对照组VC组VE组茶多酚组微生物组复合组302520151050肝脏NOS (U/mgprot)
图2-8 不同抗氧化剂对力竭游泳后小鼠肝脏中NOS活性的影响
Fig.2-8 Effects of different antioxidants on mice`s liver NOS concentration after exhaustive swiming
安静对照组游泳对照组VC组VE组TP组微生物组复合组
第29页
2.3 分析与讨论
2.3.1关于运动及疲劳态氧化应激损伤
近年来，许多研究表明，自由基是引起许多疾病和损伤等病理过程的重要因素。力竭游泳会使动物处于疲劳状态，并引起血液、心肌、肝脏等组结构和功能变化，已证明与运动性内源自由基生成增加有关[79-81]。在力竭性疲劳运动中，机体氧耗量急剧增加，自由基的生成明显增多，脂质过氧化反应增强。过多的自由基会攻击生物膜上的多元不饱和脂肪酸,，产生脂质过氧化物，从而引起生物膜的功能障碍，主要表现为膜通透性改变，导致细胞内外离子转运发生紊乱，影响肌纤维的兴奋收缩耦联、红细胞裂解（如溶血）、线粒体功能紊乱、氧代谢能力减弱、ATP[82-84]生成减少及能量供应不足等诸多生理反应，从而加重组织损伤，使机体的工作能力下降，导致疲劳，进而影响机体健康。脂质过氧化最终产物之一是丙二醛(MDA)，血清中MDA的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度；而SOD是机体清除自由基的一个重要酶，血清中SOD活力高低又间接反映了机体清除氧自由基的能力。基于以上原理，本实验中，以小鼠力竭运动氧化应激为模型，通过在小鼠的基础饲料中添加VC、VE、TP、微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂这几种不同抗氧化剂，在实验结束后，进行一次性力竭游泳实验，然后测定血清中MDA、SOD活性，来评价复合抗氧化剂对小鼠运动氧化应激的保护效果。实验结果表明，与安静对照组小鼠相比，游泳对照组小鼠在力竭游泳后血清中MDA含量下降22.86%，SOD活力显著增加94.98%(P<0.05)，肝脏中CAT活力升高12.74%。这说明，力竭游泳会使小鼠体内脂质过氧化反应增强，从而使其产物MDA含量升高，并且力竭游泳还会引起小鼠体内自由基生成增加，所以清除自由基的酶SOD、CAT活性显著提高。田京伟等用小鼠做力竭游泳实验的结果表明，力竭游泳会使小鼠血液中MDA含量和SOD活力都显著升高，与本实验结果一致。庄波[82]研究的结果也表明运动应激使大鼠血清中MDA含量、SOD活力，肝脏中CAT含量显著升高。这个结果与赖红梅[83]报道，大鼠力竭运动后即刻，血液、肝脏中GSH-Px，SOD活性比安静时显著上升的结论相似。
一氧化氮合酶NOS是催化L-Arg合成NO酶，是调节NO的最重要环节。目前研究认为，运动会导致的NO增高，主要在于运动使NOS活性增加和/或NOS基因表达上调，这主要是[87]对心血管系统研究的结果。而这种增高对机体产生有利影响包括：NO作为舒张血管因子，利于降低血管阻力增加各系统器官血流量，保证氧和营养物质供给及代谢产物清除；降低心肌耗氧量和提高葡萄糖转运入骨骼肌的速率，
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维持运动中高水平心功能和促进葡萄糖利用[88]。Maxwell[89]等研究表明，正常小鼠给予 L-Arg后，可促进运动诱导的 NO 生成并提高有氧运动能力。在本实验中，我们研究表明，力竭运动使小鼠肝脏中NOS活力显著提高27.90%(P<0.05)。
2.3.2 几种单一抗氧化剂对自由基的清除效果
已知营养物质及其代谢对自由基稳衡性动态的正常维持起到关键性的作用。在自由基生物学与医学中VC和VE均为“必需”抗氧化剂。维生素E具有强抗氧化和自由基清除能力。VE作为一个细胞内抗氧化剂的首要作用是防止细胞内和细胞膜上不饱和脂肪酸被氧化和被破坏，保护了细胞膜的完整性。生育酚与自由基起反应后，即转变为生育酚羟基自由基，此化合物可被VC、谷胱甘肽、以及辅酶Q重新还原为生育酚，重新发挥其抗氧化作用[90]。大量研究表明VE能够显著降低MDA浓度。从本试验的结果可以看出，与游泳对照组相比，饲粮中添加400 mg/kg的VE能显著提高小鼠力竭游泳时间，降低力竭游泳后小鼠血清中MDA含量，以及提高清除自由基的酶SOD、CAT的活力。VC具有保护机体免受氧自由基损伤的作用，是血浆中最有效的抗氧化剂，是细胞外液抗氧化防御体系的第一道防线。顾洪雁[91]等研究表明每天注射8mgVC能使力竭游泳后小鼠心、肝、肾、肌组织中MDA含量显著下降，肝组织中SOD含量显著上升 (P<0.05)。刘谷锋[92]等用0.1ml/10g维生素C连续灌喂小鼠14d后，研究发现VC能显著降低力竭游泳后小鼠血液中MDA水平，显著提高SOD活力(P<0.01)。本实验中，在小鼠的基础饲料中添加1 g/kg VC，结果显示，与对照组相比，VC组的小鼠力竭游泳时间增长，血清中MDA含量下降，SOD含量升高，但并无统计学意义 (P<0.05)。
茶多酚可以作为一种优良的氢或中子的给予体，和生物体在氧化还原反应中生成的过量自由基反应生成酚氧自由基，从而保护了生物体免遭自由基的损伤，生物体内许多氧化酶与自由基的生成有关，如黄嘌呤氧化酶系、髓过氧化酶、脂氧化酶和环氧酶等。TP对上述各种氧化酶有抑制作用，从而抑制自由基的生成，起到抗氧化作用。刘海军[93]用茶多酚饲喂热应激下的肉仔鸡，结果表明，TP对热应激肉仔鸡血清中MDA降低的效果显著。从本实验的结果也可以看出，与对照组相比，茶多酚能提高小鼠力竭游泳时间，降低血清中MDA含量，提高血清中SOD、肝脏中CAT活力，且差异显著 (P<0.05)。
试验用微生物抗氧化剂由光合菌和酵母菌等发酵生产，含有来源于光合菌、酵母菌及其培养物的胡萝卜素、VB1、VB2、VB12、还原型VC、槲皮酮-3-D-吡喃葡萄糖
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（栎素）、槲皮酮（类黄酮）、肌醇和多种微量元素的金属衍生物。龚灵芝等[77]，将添加2%微生物源性添加剂的试验饲粮饲喂高不饱和脂肪酸诱导的自由基损伤大鼠，结果表明，微生物抗氧化剂具有有效的清除自由基和增强体内抗氧化防御系统功能的作用。在本实验中也能看出，在饲粮中添加2 g/kg微生物抗氧化剂能显著提高小鼠力竭游泳后SOD水平，降低MDA含量，这与龚灵芝的结果一样。另外，微生物抗氧化剂提高小鼠力竭游泳时间的效果也十分显著，这说明微生物抗氧化剂能加强机体抗疲劳能力。
2.3.3复合抗氧化剂的作用效果
近年来，国内外专家分别提出了“抗氧化复合链”和“抗氧化网络”等概念，已逐渐成为抗氧化剂研究的一个热点。由海春旭[53]提出的“抗氧化复合链”假说，认为在生物体内自由基反应与脂质过氧化损伤高度相关、连锁，单一的自由基清除剂或抗氧化剂作用有限，必须由具有不同脂/水溶性质、不同分子量、不同作用位点、不同存在部位、带有不同电荷组成的“复合自由基清除或抗氧化剂”的机体防御体系-可形像比喻为“抗氧化剂复合链”，才能达到高效清除自由基损伤作用，防止由于活性氧含量过高诱发各种疾病的发生、发展，才能维护机体在一定水平上的健康状态。而由前自由基研究会主席Leater Packer博士提出的“抗氧化网络”[54]理论认为，多种抗氧化剂构成的抗氧化网络，由于抗氧化剂之间的协同作用，而使其抗氧化能力大大增强，网络抗氧化剂各组分之间存在动态的循环性相互作用，即它们都可将自身以外的至少一种抗氧化剂还原再生，使其重新拥有抗氧化能力。当它们联合作用时，还可显著提高彼此的活性，使机体维持良好的抗氧化平衡状况。而且它们在细胞内同时还能发挥各自独特的保护作用。我们通过在各实验组中分别添加VC、VC、TP和微生物抗氧化剂对小鼠抗运动氧化应激能力的研究发现，使用单一的抗氧化剂的保护作用是有限的，提示我们必须考虑抗氧化剂在体内的链式结构作用，利用综和协同效应来设计复合抗氧化剂，已达到更好的抗氧化应激效果。所以，我们以上述理论为指导，选择了VC、VE，另外添加了TP和微生物抗氧化剂，分别以各单一组分抗氧化剂组添加量的25%复合成为复合抗氧化剂添加到基础饲料中，最终VC、VE、TP、微生物抗氧化剂的活性比例接近4:1:4:1，这与王涛等[94]优选出的最佳天然抗氧化剂复合配方配方相似。我们希望这种复合抗氧化剂，能达到较好的抗氧化应激效果。
游泳至力竭时间是反映运动能力的常用指标，运动能力的提高是机体抗疲劳能力加强的最有力的宏观体现。本实验结果表明，各种单一抗氧化剂均能延长小鼠游泳至力竭时间的，而复合抗氧化剂延长了小鼠游泳至力竭时间的效果显著优于各单一抗氧
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化剂。所以，复合抗氧化剂对于提高小鼠抗疲劳能力具有显著效果。
复合抗氧化剂由于是将四种单一抗氧化剂复合，各组分之间具有较好的协同作用，所以对于运动氧化应激小鼠体内的自由基有显著地清除效果，还能提高小鼠抗氧化系统的抗氧化能力，具体表现在复合抗氧化剂组小鼠力竭游泳后血清中MDA含量显著降低37.66%，SOD活力显著提高20.44%，肝脏中CAT活力显著升高46.43% (P<0.05)，且作用效果均优于单一抗氧化剂组。说明复合抗氧化剂是能有效清除小鼠力竭运动时氧化应激造成的小鼠体内多余产生的自由基的，它还能有效提高小鼠抗氧化系统的抗氧化能力。同时，复合抗氧化剂还能使小鼠肝脏中NOS活力显著提高28.86%，从而提高小鼠的运动能力。
2.4 小 结
① 基础饲粮中添加维生素C，维生素E，茶多酚，微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂对小鼠体重和胸腺、脾脏指数有影响，但效果不显著(P>0.05)。
② 复合抗氧化剂比单一抗氧化剂具有更强的抗氧化能力，可以使小鼠血清中MDA含量显著降低37.66%，SOD活力显著提高20.44%，肝脏中CAT活力显著升高46.43% (P<0.05)。
③ 复合抗氧化剂可以使小鼠力竭游泳时间显著提高199.26% (P<0.05)。 所以，通过本试验，可以推断本研究所用复合抗氧化剂是一种能提高动物抗疲劳能力，降低运动氧化应激损伤程度的有效的抗氧化剂。
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第三章 复合抗氧化剂对仔猪断奶应激及
自由基代谢的影响
在养猪生产中，合理地仔猪饲养是养猪成功的关键环节之一，它不仅影响本阶段的生长，还严重影响以后的生产性能。现代集约化养殖猪场，已将仔猪断奶时间由7-10周龄提早到3-5周。诚然，这种早期断奶方式确实能提高母猪的生产效力和降低饲养成本，但同时，早期断奶仔猪，由于提早离开母猪、转移到新的栏舍、重新合群、高度密集、建立新的等级次序以及饲料和营养的突变等不良因素或应激原的作用，及容易引起断奶应激反应，对仔猪生长、行为、体重、血液等生化指标及机体免疫系统、疾病发生等产生不良的影响，造成重大的经济损失。
断奶应激可引起仔猪内脏器官、组织的病理损伤，其机制与氧自由基氧化损伤有关，断奶后肠绒毛萎缩，引起消化不良，促使致病性大肠杆菌大量增殖，引发炎症，在炎症发生时吞噬细胞受到刺激活化，产生呼吸爆发，释放大量活性氧自由基[95]。氧自由基在胃肠道黏膜损伤中有很重要的作用，随着研究的深入，发现氧自由基是许多致病因素引起肠黏膜损伤的共同环节[96]。自1981年Granger首次报道氧自由基与肠粘膜损伤有关以来[97]，许多学者在探讨氧自由基与肠粘膜损伤方面，做出了卓有成效的工作[98,99]。消化道粘膜遭受氧化应激损伤后，上皮细胞通透性增加，导致消化道分泌功能下降，从而影响到消化酶的分泌，使消化吸收、转运和同化代谢功能降低，进而降低饲料能量、物质利用率[95]。已有研究表明，断奶应激可降低仔猪空肠乳糖酶、麦芽糖酶活力[100]。随着对氧自由基参与粘膜损害的认识，许多氧自由基生成抑制剂和清除剂对氧自由基引起的肠粘膜损伤显示出良好的保护作用，如SOD、二甲基亚砜、别嘌呤醇、去铁胺、维生素E、A、C、硒及谷胱甘肽等抗氧化剂对氧自由基引起的组织损伤都有一定的保护作用[101]。
在本部分试验中我们将复合抗氧化剂添加到仔猪的饲料中，这种复合抗氧化剂由几种具有较好抗氧化能力的抗氧化物复合而成，通过我们的前期试验已经证明通过将这些单一抗氧化物质以一定比例复合能起到优于其中任何一组分的高效的抗氧化能力。我们希望将该种抗氧化剂加入到未断奶仔猪的饲料中，能对仔猪断奶应激起到预防和缓解作用。所以我们设计并实施了本部分实验，对复合抗氧化剂对仔猪抗断奶氧
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化应激的效果进行验证。
3.1材料与方法
3.1.1试验材料
维生素C、维生素E、茶多酚、微生物源性添加剂：同“2.1.2”； 基础日粮：新农810仔猪（前期）饲料，购于上海新农饲料有限公司； 3.1.2 实验药品
同“2.1.3”
丙二醛（MDA）检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。 3.1.3 实验仪器
同“2.1.4”
3.1.4试验动物与分组
根据品种、胎次、日龄、体重一致的原则，选择健康无病的大长二元杂交仔猪9窝，随机分为3组，每组3窝，各组仔猪数量见表3-1。对照组喂基础饲粮，试验1组（微生物组）在基础日粮中添加20 g/kg 微生物源性添加剂，试验2组（复合组）在基础日粮中添加5.75 g/kg复合抗氧化剂（每kg复合抗氧化剂含有200 mg VC、100 mg VE、450 mg TP和5 g 微生物抗氧化剂）。
试验仔猪饲养于上海创博现代农业（集团）有限公司胡桥猪场，以一窝为一单位饲养于一栏中。
表3-1 各组仔猪数量
空白组 微生物组 复合组
1 2 3 4 5 6 7 8 9
仔猪数量（只）12 10 7 8 11 5 11 9 6 3.1.5 饲养管理
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仔猪从7日龄开始诱食，饲喂上海新农饲料有限公司购买的新农810仔猪（前期）饲料，其主要原料为：玉米，小麦，乳糖，油脂，豆粕，乳清粉，白鱼粉，喷雾干燥血浆蛋白粉，大豆酶解蛋白，磷酸氢钙，石粉，食盐，赖氨酸，及微生物与微量元素预混料等，具体营养成分见表3-2。
表3-2 基础饲粮的营养成分 Table 3-2 Nutrient level in basical diet 营养成分 Nutritional level 粗蛋白质 粗纤维 粗灰分 钙 总磷 食盐 赖氨酸 水分
含量 Content ≥20.0% ≤4.0% ≤7.0% 0.7% -1.2% ≥0.6% 0.3% -1.0% ≥1.5% ≤13.0%
试验仔猪采用封闭式、半漏缝地板式高床网上平养，饮水器自由饮水。正试期试验从仔猪23日龄开始，30日龄断奶，试验期21d。即断奶前饲喂1周，断奶后饲喂2周。每天早晚各清粪一次。做好称重、耗料记录及采血前后的减轻应激的工作，记录疾病、死亡发生情况。
3.1.6血样采集
3.1.6.1 采样时间
分别在试验期的第1，8，15d（即断奶前1周，断奶后1d及断奶后1周），各采血样一次。从每窝中分别选出3只仔猪（2只公猪，1只母猪），于上午对仔猪进行前腔静脉采血用于制备血清。
3.1.6.2 采样方法及处理
每窝固定3头仔猪，仰卧保定，两前肢向后拉直或使两前肢与体中线垂直，并将头部拉直。用酒精棉球消毒锁骨窝部位，用无菌一次性注射器于前腔静脉采血。取3 ml血液，待凝血后以4000r/min低温（4℃）离心15min，制备血清样品，装于Eppendorf
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管中，于-86℃超低温冰箱中储存用于血清MDA、NO、SOD、GSH-Px 测定。
3.1.7指标测定
3.1.7.1生长性能有关指标
分别于试验期的第1d和第22d早晨以窝为单位空腹称重，并记录饲料消耗。分别计算每个实验组仔猪的平均日增量和料重比。
① 日采食量：日采食量=
配料总量−剩料量
试验天数×每组猪数
试验末平均体重−试验初平均体重
试验天数
② 平均日增量：平均日增重=③ 料重比：料重比=
平均日采食量
平均日增重
3.1.7.2抗氧化指标测定
（1） 血清中MDA含量的检测方法 ① 测定方原理：同“2.1.7.2 (1) ①” ② 加样流程：同“2.1.7.2 (1) ②”
漩涡混匀器混匀，盖好试管，95℃水浴40分钟，取出样品后流水冷却，然后3500～4000转/分，离心10分钟。取上清液，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
③ 计算公式：
血清中MDA含量(nmol/ml)=
测定管吸光度−测定空白管吸光度
×标准管浓度(10nmol/ml)×样品测试前稀释倍数
标准管吸光度−标准空白管吸光度
（2）血清中SOD活力的检测方法 同“2.1.7.2 （2）”
（3）血清中GSH-Px活力的检测 ① 测定原理：
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谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成H2O及氧化性谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。
GSH-Px
H2O2+2GSH⎯⎯⎯→2H2O+GSSG
GSH-Px的活力以催化GSH的反应速度来表示，由于这二个底物在没有酶的条
件下，也能进行氧化还原反应（称非酶促反应），所以最后计算出此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。
GSH量的测定：GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离
子呈稳定的黄色，在412nm出侧其吸光度即可计算出GSH的量。
② 加样流程 酶促反应：
加入物
1mmol/L GSH（ml） 最佳取样浓度血清（ml）
非酶管（对照管）
酶管（测定管）
0.2 0.2 -- 1.0
37℃水浴预热5分钟
试剂一（37℃预热）（ml） 0.1 0.1
置37℃水浴准确反映5分钟
试剂二（ml）
最佳取样浓度血清（ml）
2 2 0.1 --
混匀，3500～4000转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应 显色反应：
加入物
GSH标准品溶剂应用液（ml）
20μmol/L GSH (ml)
上清液 试剂三
空白管
标准管
非酶管（对照管） 酶管（测定管）
-- -- 1 1
-- -- 1 1
1 -- --
1
-- -- 1 1
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试剂四 试剂五
0.25 0.25 0.05 0.05
0.25 0.05
0.25 0.05
混匀，15分钟后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测定各管OD值。 ③ 计算公式：
非酶管OD值−酶管OD值
×标准管浓度（20μmol/L）
标准管OD值−空白管OD值
×稀释倍数×样品测试前稀释倍数 血清GSH-Px活力=
（4）血清中NO含量的检测 ① 测定原理：
NO化学性质非常活泼，在体内代谢很快转化为NO2-和NO3-，而NO2-进一步转
化为NO3-，本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原成NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。
② 加样流程
双蒸水 (μl)
100μmol/L标准应用液 (ml) 样本 (ml) 混合试剂（ml）
空白管
总NOS测定管
30 -- -- 30 200 200
混匀，37℃准确水浴60分钟
试剂三 (ml) 试剂四 (ml)
0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1
充分漩涡混匀30秒，室温静置40分钟，3500～4000转/分，离心10分钟
上清 (ml) 显色剂 (ml)
0.5 0.5 0.5 0.6 0.6 0.6
混匀，室温静置10分钟550 nm处，0.5cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
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③ 计算公式：
=总NOS含量（μmol/L）
测定管OD值−空白管OD值
×标准品浓度（μmol/L）×样品测试前稀释倍数
标准管吸光度−空白管吸光度3.1.8 数据处理与分析
用Excel 2003和SAS 9.1.3统计分析软件对数据进行处理，用ANOVA程序进行单因素方差分析，DUNCAN法进行组间多重比较，显著性水平为P＜0.05。全部实验数据均采用平均数±标准差(X±SD)表示。
3.2 结果
3.2.1 仔猪生产性能
由表3-3和图3-1、2、3可以看出，各组仔猪初始体重差异不显著，在实验结束时，与对照组相比，微生物组仔猪体重显著低15.49%(P<0.05)，复合组仔猪体重高4.29%。从日增中来看，与对照组相比，微生物组的日增重要低19.05% (P<0.05)，而
复合组日增重要高9.52% 。从料重比来看，微生物组和复合组分别比对照组低8.26%和16.51%，但差异不显著(P>0.05)。
表3-3 复合抗氧化剂对仔猪生长的影响
Table 3-3 Effects of antioxidant on the production of piglets
对照组 Control group
微生物组
Microorganism Antioxidant
group
复合组 Composite Antioxidant group
7.18±0.88
初始重（kg） Initial weight 结束重（kg） Final weight 日增重ADG（g/d） 日采食量ADFI (kg/d) 料重比
Feed conversion ratio
6.90±0.58 6.13±0.75
11.43±0.91a 9.66±0.24b 11.92±0.88a 213.3±15.3a 170.00±26.5b 226.7±5.77a
0.23 0.17 1.09±0.08 1.00±0.01
0.21
0.91±0.14
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Initial weight（kg）1412Body Weight (kg)1086420Control group Final weight（kg）Microorganism Antioxidant groupComposite Antioxidant group
图 3-1 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后体重的影响 Fig.3-1 The effects of antioxidants on body weight in piglets
Control groupComposite Antioxidant group250Daily intake(kg)Microorganism Antioxidant group200150100500平均日增重
图 3-2 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后平均日增重的影响 Fig.3-2 The effects of antioxidants on daily intake in piglets
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Control groupComposite Antioxidant group1.4Feed conversion ratiom1.210.80.60.40.20Microorganism Antioxidant group料重比图 3-3 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后料重比的影响 Fig.3-3 The effects of antioxidants on Feed conversion ratio in piglets
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3.2.2 仔猪血清MDA变化情况
由表3-4和图3-4可以看出，在对照组中，与断奶前7d相比，断奶后1d和7d时，仔猪血清中MDA分别升高24.67%、16.51%，且差异均显著(P<0.05)；同时，断奶后7d时的血清MDA含量比断奶后1d时低7.01%。在断奶后1d时，与对照组相比，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使仔猪血清中MDA降低5.99%，6.77%，但差异并不显著。断奶后7d时，微生物组和复合组仔猪血清中MDA含量分
别比对照组降低了4.42%，7.32%，其中复合组MDA含量下降显著(P<0.05)；另外与微生物组相比，复合组仔猪血清中MDA含量低3.03%，但差异不显著(P>0.05)。
表3-4 复合抗氧化剂对仔猪血清MDA的影响
Table 3-4 Effects of antioxidants on piglets’s serum MDA concentration (nmol/ml)
断奶前7日 断奶后1日 断奶后7日
对照组 Control group
微生物组 Microorganism Antioxidant group
复合组 Composite Antioxidant group
BA
3.1806±0.3687 B 3.2302±0.2678 3.1959±0.3254 AB3.9653±0.2319 A 3.7278±0.3226 3.6967±0.2645 abAaAB3.7056±0.1829 bA 3.5417±0.2971 3.4343±0.2337
注：小写字母不相同表示行之间差异显著，大写字母不同表示列之间差异显著(P<0.05)，下同。The data within a line followed by the same lowercase letter are not significantly different at 5 % level, the data within a column followed
by the same apital letter are not significantly different at 5 % level, the same in the following tables.
Control group4.3Microorganism Antioxidant groupComposite Antioxidant groupContent of MDA(nmol/ml)4.13.93.73.53.33.11814图 3-4 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后血清中MDA含量变化的的影响 Fig.3-4 The effects of antioxidants on the content of serum MDA in piglets
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3.2.3 仔猪血清SOD变化情况
由表3-5和图3-5可以看出，在对照组中，与断奶前相比，断奶1d后仔猪血清中SOD含量要高2.87%，断奶7d后低3.35%；同时，与断奶1d后相比，断奶7d后血清SOD活力降低6.05%。断奶后1d，与对照组相比，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使仔猪血清中SOD升高14.58%，11.61%，但差异并不显著。断奶后7d时，微生物组和复合组仔猪血清中SOD含量分别比对照组升高了0.54%，11.76%，
其中复合组SOD活力显著高于其他两组(P<0.05)。
表3-5 复合抗氧化剂对SOD的影响
Table 3-5 Effects of antioxidant on SOD of piglets (U/ml)
对照组 Control group
断奶前7日 断奶后1日 断奶后7日
微生物组 Microorganism
Antioxidant group
复合组
Composite Antioxidant group
AA
98.6471±10.2289 A 98.2133±11.7683 99.8587±7.0045 BA101.4807±11.4059 A 116.2798±47.0317 113.2629±9.0375 aA
95.3404±8.2602 bA 95.8587±5.9386 bAB 106.5669±13.9454
Control groupCompositeAntioxidantgroupMicroorganism Antioxidant group130The activities of SOD(U/ml)125120115110105100959085801814
图 3-5 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后血清中SOD含量变化的的影响 Fig.3-5 The effects of antioxidants on the activities of serum SOD in piglets
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3.2.4 仔猪血清GSH-Px变化情况
由表3-6和图3-6可以看出，对照组中，与断奶7d前相比，断奶1d后的血清GSH-Px水平要高8.71%，断奶后7日的要高25.96%；与断奶后1日时血清GSH-Px
要比，断奶后7d是血清GSH-Px活力高15.87%。断奶后1d，与对照组相比，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使仔猪血清中GSH-Px升高8.31%，11.96%但差异并不显著。断奶后7d时，微生物组和复合组仔猪血清中GSH-Px含量分别比对照组升高了10.92%，25.10%，其中复合组GSH-Px活力显著高于其他两组(P<0.05)。
表3-6 复合抗氧化剂对GSH-Px的影响
Table 3-6 Effects of antioxidant on the activities of serum GSH-Px in piglets（活力单位）
对照组 Control group
微生物组 Microorganism Antioxidant group
复合组
Composite Antioxidant group
断奶前7日 断奶后1日 断奶后7日
BB
602.0596±46.2784 A 593.8211±50.8629 587.3170±96.8118 BB654.5258±132.4067 A 708.9431±65.9313 732.7913±101.1304 abA
758.3740±134.3539 bA 841.1924±66.2805 948.7263±124.0206aA
Control groupComposite Antioxidant group12001100GSH-Px(活力单位)100090080070060050040018Microorganism Antioxidant group14图 3-6 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后血清中GSH-Px含量变化的的影响
Fig.3-6 The effects of antioxidants on GSH-Px in piglets
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3.2.5 仔猪血清NO变化情况
由表3-7和图3-7可以看出，在对照组中，与断奶前7d相比，断奶后1d和7d时仔猪血清中NO含量分别升高32.19%和16.66%，且差异显著(P<0.05)；同时，与断奶后1d相比，断奶后7d时血清中NO含量要低11.75%。断奶后1d时，与对照组相比，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂分别能使仔猪血清中NO升高7.19%，12.47%，但差异并不显著。而断奶后7d时，微生物组和复合组仔猪血清中NO含量
分别比对照组高12.55%，19.55%，其中复合组NO含量显著高于其他两组(P<0.05)。
表3-7 复合抗氧化剂对NO的影响
Table 3-7 Effects of antioxidant on the content of serum NO in piglets (μmol/L)
对照组 Control group
微生物组
Microorganism Antioxidant
group
复合组
Composite Antioxidant group
B
断奶前7日 77.3280±12.0725 B 78.0794±10.0408 77.6190±11.7127 B
AA断奶后1日 102.2222±14.2937 A 109.5767±16.4276 114.9735±12.0329 abAaA断奶后7日 90.2117±12.0140 bA 101.5344±12.8787 107.8466±18.7927
Control groupCompositeAntioxidantgroupMicroorganism Antioxidant group140Content of NO(μmol/L)130120110100908070601714
图 3-7 两种抗氧化剂对仔猪断奶前后血清中NO含量变化的的影响 Fig.3-7 The effects of antioxidants on the content of serum NO in piglets
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3.3 分析与讨论
3.3.1 断奶对仔猪氧化还原状况的影响
断奶对仔猪有很强的应激作用，特别是营养、环境条件改变的应激，可使仔猪抗氧化体系紊乱，免疫功能下降，同时引起机体血液、内分泌和神经系统等一系列的变化。仔猪在正常生理条件下体内自由基的产生与清除处于动态平衡。而在断奶应激状态下，机体会在代谢过程中产生大量包括O2-·，H2O2等在内的自由基，它们是一种强氧化剂，除了直接造成生物膜损伤外，还可通过脂类氢过氧化物与蛋白质（包括酶）或核酸等的反应使机体组织发生广泛损伤。
MDA是脂质过氧化的终末代谢产物，其含量反映氧自由基介导的脂质过氧化程
度。MDA是极活跃的交联剂，可使细胞发生交联而失去活性，导致变性、坏死[102]。本实验的结果表明，与断奶前相比，断奶1d后，仔猪血清中MDA含量分别上升24.6%和16.51%，这说明断奶引起了仔猪的氧化应激，断奶应激直接导致仔猪脂质过氧化增强，所以其产物MDA含量显著升高；而与断奶1d后相比，断奶7d后仔猪血清中的MDA又下降了7.01% (P>0.05)，产生这种MDA下降的原因，应该是仔猪自身的抗氧化系统，对仔猪断奶应激作用下产生的自由基有一定的清除能力，随着断奶时间的推移，机体抗氧化体系的这种清除能力已经表现出它的效果，断奶7日后仔猪断奶应激产生的影响已经有减缓趋势，不过此时的作用效果仍然不显著。并且相对于断奶前的MDA水平仍旧高16.51%，说明断奶引起的仔猪应激过程中自由基的增加仍旧存在。
自由基理论认为，生物体内存在自由基的清除系统，抗氧化酶系统就是其中的一种。SOD和GSH-Px都属于机体的抗氧化酶系，在机体抗氧化方面起着重要的作用。SOD是自由基损害的主要防御酶，可催化超氧阴离子自由基的转化反应，从而阻断
自由基的连锁反应，减少O2-·对机体的损伤[103,104]，提高机体的抗氧化水平。GSH-Px的生理作用主要是清除脂质过氧化物，并在过氧化氢酶含量很少或H2O2产量很低的组织替代过氧化氢酶清除H2O2，通过体内和体外实验证明，GSH-Px清除脂类氢过氧化物的速度决定于GSH-Px的浓度。各种抗氧化酶之间具有协同作用，它们能有效阻止生物膜发生自由基连锁反应，防止发生膜脂质过氧化作用，从而保护组织细胞免受氧化剂的伤害[105]。对照组中，与断奶前7d相比，断奶后1d时仔猪血清中SOD活力高2.87%，GSH-Px活力要高8.71%，这说明，断奶应激产生的自由基升高启动了仔猪体内抗氧化酶系的保护防御机制，仔猪自身积极地产生SOD，GSH-Px等抗氧化酶，
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来清除断奶应激引起的仔猪机体内自由基升高。而断奶后7d，比断奶前7d时要低3.35%，血清GSH-Px水平要高23.96%；比断奶后1d时血清SOD活力降低6.05%，GSH-Px升高15.87%。这说明，随着时间的推移，仔猪自身的抗氧化防御系统对仔猪
的抗应激产生了效果。
NO在维持肠道正常生理功能中发挥作用。影响仔猪生理功能和生长情况的断奶
综合症主要是由营养应激引起的。仔猪断奶后，食物物由母乳变为固态饲料，仔猪对这一转变的反应先是拒食，而后是因饥饿而过度采食。拒食可造成消化酶活性降低，小肠绒毛萎缩，使消化和吸收功能下降。饥饿后的过度采食，使消化道内的养分增多，一方面促进了大肠杆菌等有害菌的繁殖，另一方面引起蛋白质的腐败和肠道对植物性蛋白质的超敏反应。杨全明(1995)报道：断奶可使小肠绒毛萎缩、模糊，消化酶活性降低，引起消化和吸收功能下降。并且众多的研究也表明，断奶仔猪腹泻的原发性因素不是大肠杆菌或其它有害菌感染和轮状病毒感染，而是由断奶营养应激造成的肠道损伤，导致仔猪小肠在形态和功能上的异常，肠道形态学的变化（包括固有膜厚度的增加，肠绒毛高度的降低和腺窝深度的增加）将引起功能上的改变和肠道吸收机能的降低。最近研究表明，仔猪断奶时肠道的损伤可能与内毒素对小肠粘膜的损伤有关。内源性 NO可以维持急性内毒素侵害后的小肠黏膜血管床的完整性[106]。因此，内源性 NO可能保护肠黏膜免遭内毒素的损害。内毒素可以刺激氧自由基的形成，超氧离子可以导致小肠黏膜的损伤。NO可以与超氧离子结合，减轻其毒性作用；NO也可作为抗氧化剂，减轻内毒素引起的小肠黏膜微血管床的损害。持续存在的NO还可以稳定巨噬细胞，防止其通过脱颗粒和释放炎症介质，增加肠道通透性[107]。NO还可调节肠道水和电解质的转运。Barry[108]认为，内源性 NO可促进小肠上皮细胞的吸收功能。在大鼠的实验中，NO拮抗剂能增加内毒素引起的小肠粘膜损伤和血浆外渗，释放氨基甲酰青霉素氨，能减轻内毒素引起的小肠黏膜损伤，说明NO对肠粘膜有保护作用。其机理除扩张小肠黏膜血管和改善微循环外，可能与内毒素刺激下产生有毒的超氧离子等自由基发生反应，产生低毒或无毒分子[109]。所以，NO在仔猪断奶阶段，应该是对仔猪的肠道保护作用处于优势地位。由于NO在肠道中的特殊保护作用，与断奶前7d相比，断奶后1d时仔猪血清中NO含量要高32.19%，断奶后7d时血清NO含量要高16.66%，这可能是由于，断奶应激主要影响了仔猪的消化系统，尤其是
小肠，而仔猪自身的修复作用，促使血液中的NO含量增加。
综上所述，断奶会引起仔猪的应激反应，从而使仔猪体内自由基含量上升，同时仔猪自身的抗氧化酶系也积极地发挥着清除自由基的作用。
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3.3.2 复合抗氧化剂对仔猪断奶应激的影响
断奶会引起仔猪强烈的应激反应，主要表现在自由基大量增加，脂质过氧化增强等。复合抗氧化剂凭借各组分之间的协同增效作用，发挥着很好的清除机体自由基，提高机体抗氧化能力的作用。复合抗氧化剂的主要成分包括VC、VE、TP和微生物源性抗氧化剂等，它们都是很好的抗应激物质。赵君梅[110]将75mg/kg维生素C添加到断奶仔猪的饲料中，结果表明，VC能促进肠道的吸收能力，缓解断奶应激，对仔猪免疫系统的发育也有一定益处。郇秀荣[111]等，通过实验证实，VE对仔猪抗转群应激有一定的效果。林智[112]等将茶多酚添加到仔猪饲料中，发现茶多酚能减轻断奶使仔猪产生的不良应激。孙婷婷[113]研究表明，用微生物抗氧化剂饲喂妊娠母猪发现，它可以使母猪断奶后血清MDA含量下降，SOD和GSH-Px活力升高，提高母猪的抗氧化能力。
复合抗氧化剂通过将这几种单一抗氧化剂以一定比例复合，使其具有优于单一抗氧化剂的清除机体自由基，提高机体抗氧化性能的能力。通过实验一我们已经可以看到复合抗氧化剂对于疲劳态氧化应激有一定的效果。而在本部分实验中，我们可以看出：
在仔猪饲料中添加抗氧化剂从断奶前1周开始饲喂仔猪的实验结果表明：断奶1d后，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂的实验组仔猪，血清中MDA含量分别比
对照组低5.99%和6.77% (P<0.05)。从中我们可以看出，断奶前饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂均有降低仔猪断奶后血清中MDA含量，减轻断奶应激影响的趋势，但此时还并无统计学上的意义。在断奶7d后，微生物组和复合组仔猪血清中MDA含量分别比对照组降低了4.42%，7.32%，其中复合组MDA含量降低最效果显著 (P<0.05)。从中可以看出，在断奶7d之后，复合抗氧化剂已经表现出很明显的，减轻
仔猪断奶应激引起的脂质过氧化程度的效果。这与试验一中复合抗氧化剂发挥的抗氧化应激的效果一致。所以，我们可以说复合抗氧化剂对于减轻断奶应激对仔猪造成的脂质过氧化损伤有明显的作用。
另外，通过对仔猪断奶前后血清中抗氧化酶SOD和GSH-Px活力的测定，我们也得到了类似的结果。在断奶1d后，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂的实验组仔猪血清中SOD活力分别比对照组高14.58%、11.61%，GSH-Px活力高8.31%，11.95% (P<0.05)。这说明在断奶前饲喂抗氧化剂已经有提高仔猪抗氧化酶的活力的趋势，但
还不显著。而对于断奶7d后仔猪血清中的SOD活力的测定结果则表明，断奶7d后，饲喂微生物抗氧化剂和复合抗氧化剂的实验组仔猪血清中SOD活力分别比对照组高
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0.54%、11.76%，GSH-Px活力高10.92%、25.10% (P<0.05)，其中复合组中SOD、GSH-Px
活力显著高于其他两组(P<0.05)。SOD作为清除O2-·的酶，其在氧化应激中具有很强的清除自由基，有效防止自由基对机体损伤的能力。GSH-Px则能清除H2O2和脂质过氧化物，减轻有机氢化物对机体的损伤。仔猪发生断奶应激时，机体大量产生自由基，仔猪的免疫系统严重紊乱，此时，机体需要大量的抗氧化酶来清除这些多余的自由基。由于断奶仔猪的生理特点，其免疫能力还发育不完全，机体抵抗应激的能力有限，所以，仔猪断奶时容易引起机体严重的损伤和疾病。我们将复合抗氧化剂添加到仔猪断奶前后的饲料中饲喂仔猪，复合抗氧化剂中的成分能直接清除自由基或提高动物机体免疫及抗氧化的能力。所以，添加复合抗氧化剂的实验组中，仔猪血清中SOD及GSH-Px的活力都要高于对照组。
3.4 小 结
① 断奶会对仔猪造成较强的应激，它会带来自由基大量增加，脂质过氧化显著
增强，抗氧化体系紊乱等强烈的氧化应激反应。
② 复合抗氧化剂能提高仔猪抗断奶应激的能力，具体表现在它能降低血清中脂
质过氧化产物MDA的含量，提高过氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶的活力，增强一氧化氮对仔猪肠道的保护与参与修复应答的能力。
③ 复合抗氧化剂有提高仔猪日增重和饲料报酬的趋势。
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第四章 结 论
根据本次试验结果，可以得出如下结论：
1、动物处于疲劳态时，机体内存在大量的自由基，并诱发氧化应激，导致机体
的氧化损伤。VC、VE、TP、茶多酚、微生物源性抗氧化剂和复合抗氧化剂均对力竭游泳引起的机体氧化损伤有一定的缓解作用。而这其中由VC、VE、TP、茶多酚和微生物源性抗氧化剂以一定比例复合而成的复合抗氧化剂具有优于其它单一抗氧化剂的清除自由基，提高机体抗疲劳和抗氧化能力的作用。
2、断奶会引起仔猪机体自由基大量增加，脂质过氧化显著增强，抗氧化体系紊
乱等强烈的氧化应激反应，从而使仔猪发生氧化应激损伤。复合抗氧化剂能显著提高仔猪对断奶时氧化应激的抵抗能力，减轻氧化应激造成的脂质过氧化损伤。同时，复合抗氧化剂有提高仔猪日增重和饲料报酬的趋势。
总之，复合抗氧化剂是一种有效地能清除自由基，提高机体抗疲劳、抗氧化能力的抗氧化剂。
第51页
参考文献
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第58页
附 录
缩略语 （Abbreviation）
缩略语
英文名
中文名
FR Free radical 自由基 OFR ROS RNS HO-· O2-·
Oxygen free radica Reactive oxygen species Reactive nitrogen species
Hydroxyl radical Superoxide radical
氧自由基 活性氧族 活性氮族 羟自由基 超氧自由基
VC Vitamin C 维生素C VE Vitamin E 维生素E TP Tea phonenic 茶多酚 MDA Malondialdehyde 丙二醛
超氧化物歧化酶 SOD Superoxide dismutase 过氧化氢酶 CAT Catalase GSH-Px Glutathione peroxidase
谷胱甘肽过氧化氢酶
NO Nitric Oxide 一氧化氮
一氧化氮合酶 NOS Nitric oxide synthase
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致 谢
本论文是在导师徐建雄教授的悉心指导下完成的，从实验的设计到论文的撰写
以及修改，导师都提出了宝贵的意见和建议。两年半来，恩师在学习、生活等方面都给予了我悉心的指导和亲切的关怀。导师深厚的学术功底，严谨的治学态度，广博的专业知识和对科学执着追求的精神，都令我受益匪浅，是我学习的榜样。另外，导师的温文儒雅的气质，耐心的教导，语重心长的关心，都令我感激。在此，谨向恩师以及师母致以崇高的敬意和真挚的感谢。
感谢陈小连老师，在试验设计与实施过程中过程中给予我的指引与帮助。她长远的思考方式，精细的辨别分析能力，扎实的实验技术都令我受益匪浅。
衷心感谢上海创博现代农业有限公司-胡桥猪场提供试验场地、试验动物。感谢该公司领导，李厂长，饲养员老崔夫妇，马登亮，王平安等在整个试验过程中给予的大力支持和帮助。
在两年半的研究生学习和生活过程中，感谢上海交通大学我提供良好的学习和生活场所，农业与生物学院的老师传授给我丰富的专业知识！
本班的蒋越、李峰、戢太云、张燕等同学两年半来对我的关心和帮助也让我感激不尽。
在实验过程中同门李龙、刘瑞丽，师姐龚灵芝，师妹王啸春、王雅芬、李杏，师弟赵柯立等都给予了我莫大的帮助，在此谨向他们表示最诚挚的谢意。
求学期间，远方的父母和亲人们给予了最大的关心和支持，使我能够安心学习，顺利完成论文的研究工作，在此表示最衷心的感谢和最崇高的敬意。
最后，向两年半以来所有一直关心和支持我的老师、同学及友人表示诚挚的谢意。
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攻读学位期间发表的学术论文目录
1. 韩雪, 陈小连, 徐建雄. 复合抗氧化剂对小鼠氧化应激与自由基代谢的影响[J]. 上海交通大学学报（农业科学版）.（已录用）
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