RNA提取
1、 将涡虫吸干水分,加入500μl 裂解液,55℃水浴裂解1h。
2、加入等体积酚/氯仿(1:1),冰上放置15min。
3、 4℃,12000g离心20min,留上清。
4、加入等体积氯仿,4℃,12000g离心5min,留上清。
5、加入0.1倍体积醋酸钠,2.5倍体积无水乙醇,-20℃放置30min。4℃,12000g离心20min,去上清。
6、70%乙醇洗涤沉淀,4℃,12000g离心5min,去上清。
7、 使沉淀干燥,溶于30μl 无RNase污染的去离子水中,-70℃保存或现用。
RT-PCR
将上述制备的RNA 10μl与2μl OligodT(10mmol/l)混合均匀,70℃水浴热激5min。立即放冰上静置几分钟,然后加入5μl 5×RT M-MLV 缓冲液,1μl dNTPs(10mmol/l),1μl RNase 抑制因子 (40U/μl),1μl M-MLV 逆转录酶(50U/μl),加水至25μl。然后放入PCR仪中进行如下操作:37℃ 15min,42℃ 1h,70℃ 15min。得到的cDNA于-20℃保存。
线虫RNA提取用裂解液:0.5 % SDS,5 % 2-巯基乙醇,10 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl,0.5 mg/ml蛋白酶K。。
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