研究报告
ResearchReport
水稻MOC1mRNATaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
高东*孙宏伟*刘雪清
明,650201*同等贡献作者
**通讯作者,yppl@public.km.yn.cn
何霞红王云月李成云朱有勇**
云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心,农业生物多样性和控制病虫害教育部重点实验室,云南省植物病理重点实验室,昆
摘要TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒，作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1
mRNA的标准品，建立了检测方法。采用RT-PCR的方法，从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA，PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段，将纯化的目的片段与pMD19－TSimple载体连接，转化宿主菌JM－109，提取重组质粒DNA，PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值，确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法，特异性好，检测灵敏度达102拷贝，线性范围为102~107拷贝，阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r＝0.999)，扩增效率高(E＝92.8%)。成功建立了MOC1基因实时荧光PCR定量标准品，且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1mRNA的表达进行准确定量。
关键词水稻,分蘖,基因表达,实时定量RT-PCR,TaqMan探针
EstablishmentofReal-timeTaqMan-FluorescenceQuantitativeRT-PCRAssayforDetectionofMOC1mRNAExpressioninRice
GaoDong*SunHongwei*LiuXueqingHeXiahongWangYunyue
KeyLaboratoryofPlantPathology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,650201*Theauthorswhocontributeequally
**Correspondingauthor,yppl@public.km.yn.cn
LiChengyunZhuYouyong**
TheNationalCenterforAgriculturalBiodiversity,MinistryofEducationKeyLaboratoryofAgriculturalBiodiversityforPlantDiseaseManagement,
AbstractThecDNAofMOC1ofricewasTAclonedasthestandardforreal-timetranscriptsandtheTaqManfluorescencequantitativePCRassayfordetectingMOC1geneexpressionwasestablished.TotalRNAextractedfromtilleringbudofricewasreversetranscribedtocDNA.Theprospectiveampliconwasamplifiedandpurified,thenwasligatedwithpMD19－TSimplevectorandtransformedintobacteriumJM－109.PlasmidDNAextractedfrompositivecloneswasverifiedbyPCRamplificationandsequenced.TheconcentrationofpurifiedDNAtem-platewasdetectedbyanalyzingabsorbancein260nmandthenthecombinedplasmidwasdilutedtoseriesasstandardforFQ-PCR.MOC1wasamplifiedbyreal-timefluorescencequantitativePCRfromtheplasmidDNA.ThemethodofMOC1mRNAreal-timePCRwaswellestablished,whichdetectedaslowas102copieswiththelinearrangefrom102to107copies.Thestandardcurvesshowedhighcorrelations(r＝0.999)andPCRefficiency(E＝92.8%).Aseriesofstandardsforreal-timePCRanalysishavebeenconstructedsuccessfully,andreal-timeTaqMan-FluorescenceQuantitativeRT-PCRisreliabletoquantitativelyevaluatemRNAofMOC1ofrice.KeywordsRice(OryzasativaL.),Tillering,Geneexpression,Real-timeRT-PCR,TaqManprobe
分蘖是水稻、小麦等禾本科农作物非常重要的农艺性状之一，分蘖的多寡可直接影响此类作物的
基金项目：本研究由国家973计划项目(2006CB100200)资助产量。水稻是单子叶模式植物，因此，水稻分蘖的分
子生物学研究，对提高作物的产量具有重要意义。李
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
家洋等在粳稻品种H89025中发现了天然moc1突变体，该突变体只有一个主茎秆，完全丧失了分蘖能力(郭龙彪等,2006)。研究发现MOC1位于第6染色体上。moc1突变体受单个核隐性基因控制，由于在MOC1基因ORF1编码区内插入了一个1.9kb的逆转座子序列，转录中断，从而造成蛋白质的翻译提前终止。MOC1编码GRAS家族的转录因子，决定腋生分生组织起始和生长(Lietal.,2003;WangandLi,2006;郭龙彪等,2006)。在腋生分生组织形成之前，MOC1基因就已经在叶腋内的少数表皮或亚表皮细胞中表达，并且MOC1基因的表达伴随着腋生分生组织形态建成的整个过程；在腋生分生组织分化形成分蘖芽以后，MOC1仍然在整个分蘖芽中表达(Lietal.,2003;WangandLi,2006)。准确定量MOC1在分蘖芽形态建成过程中的表达情况是分析MOC1基因在水稻分蘖过程中的作用以及更好的利用MOC1基因，增加作物单产的基础。灵敏、有效和精确的MOC1mRNA定量方法的建立具有重要意义和应用价值。
实时荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)技术是一类新型准确的基因定量方斑点印迹法等相比，具有准法，与Northern印迹法、确、敏感、简便等特点(Orlandoetal.,1998;阳成波等,2003;欧阳松应等,2004)，在微生物检测、转基因食品检测、基因表达研究等方面具有重要的应用价值(张立国和张琚,2003;廉红霞等,2008)。FQ-PCR中的TaqMan荧光探针法，采用特异性的探针和引物，巧妙利用Taq酶的5'→3'核酸外切酶活性使报告基团和淬灭基团分离，进而实时监测荧光信号。TaqMan探针法可避免非特异产物产生荧光信号，克服了荧光染是目前使用最料SYBRGreenI在此问题上的缺陷，
为广泛的实时荧光定量技术(Hollandetal.,1991;廉红霞等,2008)。在实时荧光定量系统中，一套优质的
andSynthesisSystemforRT-PCR)；多糖多酚植物总
RNA快速提取试剂盒和多功能DNA纯化回收试剂盒均为北京百泰克生物技术有限公司产品；EXTaq誖(DRR100A)、DL2000DNAMarker、pMD19－TSimple载体系统试剂盒(D102A)、感受态细胞JM－109(D9052)、Amp、X-Gal、IPTG、PremixExTaqTM(DRR039)均购自宝生物工程(大连)有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；梯度PCR仪Eppendorf5333PCRMastercyclerGradiet(德国)；实时荧光定量PCR仪iCycleriQTM(伯乐)，紫外凝胶分析系统(伯乐)；GeneAmpSequenceDetector5700、SequenceDetectionSystem为AppliedBio-systems公司产品。
1.2引物和探针的设计与合成
在GenBank中查找MOC1基因的碱基序列(Gen-BankAccession:AY242058)，采用PrimerExpressVersions2.0设计TaqMan引物及探针，并通过NCBI公共数据库Blast功能，初步检测引物和探针的特异性。引物及探针序列：上游引物：5'－AGACGCTCGCCGTGAACT－3'；下游引物：5'－GCCTTCACCCACTTCAAGA－3'；TaqMan荧光探针序列：5'－(FAM)TCTTGCACAACCTGGCCGGC(TAMRA)－3'。引物及探针由中国科学院上海闪晶分子生物科技有限公司合成。1.3组织总RNA制备
按试剂盒说明书提取水稻分蘖芽总RNA，加入30μLDEPC处理水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，－80℃保存备用。1.4逆转录反应(RT-PCR)
采用InvtrogenSuperScriptTMIIIFirst-StrandSyn-标准品是准确、灵敏、可重复定量的基础(罗勇军和thesisSystemforRT-PCRKit进行逆转录反应。使用
短暂离心各组分。配制RNA、引物混合体系：刘昕,2005)。目前，带有目的扩增片段的重组质粒标前混匀、
1μL1μLoligo(dT)20(50μmol/L)，稳定、高效的定量标准品。2μL总RNA，准品是广泛使用的同源、
6μLDEPC-treatedwater，本研究旨在通过TA克隆法克隆水稻分蘖基因dNTPmix(10mmol/L)，
迅速放于冰中至少1min；配置cD-MOC1的目的片段cDNA，为MOC1基因的mRNA65℃温育5min，
2μL10×RTbuffer，4μLMgCl2
实时荧光定量检测提供质粒标准品，从而建立一种NA合成混合体系：
(25mmol/L),2μLDTT(0.1mol/L)，1μLRNase-简便的检测方法。准确、
1μLSuperScriptTMIIIRT；将10μLcDNA合OUTTM，
成混合体系加入RNA、引物混合体系中，离心混匀。1材料与方法
50℃温育50min。85℃，5min终止反应，迅速放于冰
主要材料1.1
中。短暂离心，加入1μLRNaseH，37℃温育20min。
RT-PCR体系(InvtrogenSuperScriptTMIIIFirst-Str－20℃保存或立即用于PCR。
水稻MOC1mRNATaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
EstablishmentofReal-timeTaqMan-FluorescenceQuantitativeRT-PCRAssayforDetectionofMOC1mRNA
1199
中，1OD260=0.05g/L双链DNA；1对碱基平均分子量=660g/mol；MOC1重组质粒2778bp；6.02×1023
20μL反应体系包括：13.5μLddH2O；2μL10×
为阿佛加德罗常数。
ExTaqBuffer(Mg2+Plus)；1.6μLdNTPs(2.5mmol/L)；
制备108copies/μL数量级的溶液作为标准品原
0.4μLForwardPrimer；0.4μLReversePrimer；0.1μL
液，贮于－80℃。将重组质粒标准品原液10倍梯度稀
TaKaRaExTaq(5U/μL)；2μLcDNA。扩增参数为：
释成107~101copies/μL数量级的标准品，进行MOC1
95℃，预变性10min，95℃变性30s，60℃退火30s，
实时荧光定量PCR检测，每个样品3次重复，根据
共40个循环；72℃延伸3min。
临界循环数(Thresholdcycle,Ct)以及模板起始拷贝
配制1%琼脂糖凝胶，取20μLPCR产物与4μL
数制作标准曲线和标准方程。
6×载样缓冲液混合，5V/cm电泳30min左右。在长1.5PCR扩增及纯化
尽波紫外灯下用干净刀片切下含86bp条带的胶块，量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶越小越好。将切下含DNA的凝胶放入1.5mL的离心管，称出含DNA凝胶的重量。按多功能DNA纯化回收试剂盒使用说明书纯化PCR产物。1.6cDNA目的片段克隆
在微量PCR管中配制下列组份，5μLLigationMix(使用前冰中融化充分振荡混匀)、1μLpMD19－T1μL目的片断(约0.2pmol)、3μLSimpleVector、ddH2O，16℃连接反应30min。加入到100μLJM－109感受态细胞中(使用前冰中融化)，冰中放置30min。42℃加热45s后，再在冰中放置1min。加入890μLSOC培养基，37℃，150r/min，振荡培养60min。涂布于含有X-Gal(40mg/L)、IPTG(24mg/L)以及Amp(100mg/L)的LB琼脂平板培养基上，将平板倒置于37℃培养箱中过夜培养，形成单菌落。挑取1个蓝色菌落，4个白色菌落(选择菌落小的)，各接种于含3mLLB、3μLAmp培养基的试管里，37℃，220r/min，摇
1.9实时荧光定量PCR检测
在荧光定量PCR仪上扩增并检测荧光，25.0μLPCR反应液包括：8.5μLddH2O、上下游引物各0.5μL
(10μmol/L)、1.0μLTaqMan水解探针(10μmol/L)、12.5μLpremixExTaq(2×)和2.0μLcDNA。扩增参数为：95℃，预变性10s；95℃变性30s；59℃，退火30s，收集荧光，循环42次。
2结果与分析
2.1RNA纯度和完整性分析
提取的总RNA经凝胶电泳鉴定，18S和28S两条带清晰、完整，无明显降解，OD260/OD280值为1.9以上，符合试验纯度和逆转录要求(结果未列出)。2.2PCR鉴定阳性重组质粒
质粒载体pMD19－TSimple结构如图1所示，提取质粒DNA质量高(图2C)。以重组质粒DNA作模
板，用质粒引物(图1)和MOC1(TaqMan)引物对重组质粒进行NestPCR扩增。结果显示：MOC1引物床培养15h。
对白菌落质粒(1、2、3泳道)扩增产物与理论值86bp
1.7重组质粒鉴定
吻合，而对蓝菌落质粒(4泳道)没有扩增产物(图
用质粒引物(5'－GAGCGGATAACAATTTCACA2D)；质粒引物对白菌落质粒(8、7、6泳道)扩增产CAGG－3'和5'－CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA物与理论值242bp吻合，而对蓝菌落质粒(5泳道)C－3')和MOC1(TaqMan)引物对重组质粒进行Nest扩增产物与理论值156bp也吻合(图2D)。同时，PCR扩增，观察是否有预期目的片段。取正确插入目阳性质粒的测序鉴定结果显示，插入片段序列与的片断的质粒菌液1mL送华大基因研究中心测序，NCBI上公布序列的相应片段相似性为100%(结果测序结果经Blast进行相似性分析。未列出)。1.8重组质粒浓度测定及标准曲线的建立
采用质粒提取试剂盒提纯质粒，测定OD260/OD280
分析纯度，备用。根据重组质粒提取物OD260nm吸光度，并通过如下公式计算纯化产物原液的浓度。
DNA模板浓度(copies/μL)=[A260×0.05×10－6g/μL×50(稀释倍数)/(660g/mol×碱基对数)]×6.02×1023。其
2.3重组质粒序列分析
采用通用引物M13F－47和M13R－48对重组质粒DNA进行双向测序，序列分析结果经GenBank
Blast比对，与MOC1已知cDNA序列对应片段完全相同。说明目的片段已成功重组于载体中并保持了序列的完整性。
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图1pMD19－TSimple质粒结构图
Figure1TheframeworkofplasmidspMD19－TSimple
图2重组质粒的PCR鉴定
注:M:DL2000Markers;A:以cDNA为模板扩增得到的MOC1目的片断1.5%琼脂糖电泳图,1、2泳道均为目的片段;B:割胶回收纯化得到的MOC1目的片断1.5%琼脂糖电泳图,泳道为纯化目的片段,C:MOC1克隆质粒0.8%琼脂糖电泳图,1~4泳道为白斑,5为蓝斑;D:MOC1引物和pMD19－T自身引物NestPCR抽提到质粒的1.5%琼脂糖电泳图,1、2、3泳道是白菌落质粒
7、6、5泳道是用pMD19－T自身引物PCR后产物MOC1引物PCR后产物,4为蓝菌落,分别对应的8、
Figure2IdentificationofrecombinantplasmidsbyPCR
Note:M:DL2000Markers;A:Agarosegelelectrophoresis(1.5%)oftheprospectiveampliconwasamplifiedfromthecDNA,1and2aretheprospectiveamplicons;B:Agarosegelelectrophoresis(1.5%)ofthepurifiedprospectiveamplicon,1isthepurifiedprospectiveamplicon;C:Agarosegelelectrophoresis(0.8%)ofthecombinedplasmid,1~4arewhitelawns,5isbluelawn;D:NestPCRcombinedplasmidbyprimersofMOC1andpMD19－T,1~4areampliconsofprimersofMOC1,1~3arewhitelawns,4isbluelawn;8~5aream-pliconsofprimersofpMD19－T,respectivelysymmetricalto1~4
2.4标准曲线的建立及线性检测范围
实验得出的常态型扩增曲线(图3)和对数型扩增曲线(图4)显示：总体上所有曲线的拐点清楚，指数增长期明显，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显，一方面说明灵敏度高，另一方面不
扩增曲线的整体平行性好，相邻浓度标准品扩增曲线与曲线之间的间距都十分接近3.32，是扩增效率都高的反映。图4显示我们建立的扩增曲线的Ct值在16~36范围内，起峰范围适当，保证了定量的准确性。
本研究成功建立了MOC1基因实时荧光PCR定
Y=－3.509X＋43.999，r=0.999，易出现假阳性、假阴性的误判；曲线指数期斜率大，量标准曲线方程(图5)：
X代表模板量的对数值。其线性表明扩增效率高，试剂灵敏度、引物和探针效果好；其中Y代表Ct值，
水稻MOC1mRNATaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
EstablishmentofReal-timeTaqMan-FluorescenceQuantitativeRT-PCRAssayforDetectionofMOC1mRNA
表1MOC1标准品的批内和批间重复性
Table1Thefidelityintra-andinter-batchofMOC1重复性Repeatability批内重复性Intra-batch
MOC1标准品MOC1standardsubstances4.04×1074.04×1064.04×1054.04×1044.04×103
图3MOC1基因的实时荧光定量PCR扩增曲线(常态型)
Figure3Real-timefluorescencequantitativeamplificationcurveofMOC1(normalview)
4.04×102
批间重复性Inter-batch
4.04×1074.04×1064.04×1054.04×1044.04×1034.04×102
16.6420.0223.4326.9630.6634.1816.7020.0923.5227.0530.6034.30
0.0430.0270.0350.0420.0540.0980.0500.0510.0640.0600.0870.102
Ct(mean)
SD
1201
CV(%)
0.260.130.150.160.180.290.300.250.270.220.280.30
Note:UnitsofMOC1standardsubstancesarecopies/2μL
图4MOC1基因的实时荧光定量PCR扩增曲线(对数态型)Figure4Real-timefluorescencequantitativeamplificationcurveofMOC1(logview)
好。批内变异系数(CV)为：0.13%~0.29%；批间变异系数为：0.22%~0.30%。结果显示相同样本不论浓度高低，Ct值都具有良好的重现性，并且CV值都很小，说明同一样本的扩增效率在批内、批间都是比较一致的，而且具有良好的重现性。
实验结果显示我们建立的克隆质粒标准品检测范围宽、灵敏度高，初始模板的拷贝数低至102数量级，同样可以准确检测到，定量结果准确、可靠。
3讨论
TaqMan实时荧光定量PCR体系优劣的两个主要判定参数是标准曲线的斜率及相关系数，本研究所建立体系的斜率及相关系数显示该体系是一个优良的mRNA表达定量体系。mRNA表达检测以往经常采用Northern印迹法、半定量RT-PCR和竞争性RT-PCR等(Laduetal.,1991;Ranganathanetal.,1995;Kratkyetal.,2001;Esenabhaluetal.,2002;高勤学等,2004)，但是，这些方法在准确定量方面均存在不足。TaqMan荧光定量PCR具有很高的灵敏度和非常好的动力学检测范围(Giuliettietal.,2001;Alkanetal.,2006;杨凤秋和朱正歌,2006)，其原理是设计一条能与PCR产物特异杂交的探针，该探针的5'端标记
3'端标记荧光淬灭基团荧光报告基团FAM等，
TAMRA等，探针在非特异性PCR发生时，荧光信号不改变；当有特异性PCR扩增发生时，Taq酶的5'外切酶活性将探针5'端连接的荧光基团从探针上切割下来，引起报告基团荧光信号的增长(Stryer,1978;
图5MOC1基因的实时荧光定量PCR标准曲线
Figure5Real-timefluorescencequantitativestandardcurveofMOC1
范围可达6个数量级，Ct值和起始模板拷贝数的相
关性均较好(r=0.999)，标准曲线的斜率接近理想值
扩增效率为92.8%。－3.320，
2.5标准品的重复性和灵敏度
将系列稀释的标准品各浓度梯度用荧光定量PCR重复测定，批内、批间各5次，每次每个稀释度
重复3管，结果(表1)显示批内和批间重复性均较
1202
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MolecularPlantBreeding
Cardulloetal.,1988;Bustin,2000)，如此反复，每发生一次特异性PCR扩增，仪器就收集一次荧光信号，保证了荧光信号强度与探针和特异性片段的结合数成正相关，这样循环阈值就与PCR体系中起始DNA量的对数值之间有了严格的线性关系，因此根据样品的循环阈值参照标准曲线，可准确计算出标本内核酸的起始浓度(Heidetal.,1996;杨建荣和陈晓东,2002;王梁燕等,2004)。许多研究证明TaqMan荧光定量比Northern印迹法灵敏，且与半定量RT-PCR及竞争性RT-PCR相比更为灵敏、省力(Bonnetetal.,2000;孙淑斌等,2006)。本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR法能够准确检测水稻农艺性状相关基因MOC1的mRNA表达量，与传统检测方法相比更为迅速、准确、灵敏。
TaqMan实时荧光定量PCR体系标准品的选择是多样的，有实验者直接将实验样品梯度稀释作为标准品，也有使用外源合成DNA的，但是这些方法很难保证标准品的稳定性以及标准品同检测样品扩增效率的一致性。本研究选择TaqMan荧光探针法对水稻农艺性状相关基因MOC1的mRNA表达进行定量检测。考虑到mRNA的易降解性可能导致标准品的不稳定从而引起结果的不准确，笔者采用TA克隆法克隆MOC1cDNA，以重组质粒DNA为标准品(Bielefeldt-OhmannandFitzpatrick,1997)，所设计引物及探针序列特异，扩增测序显示与NCBI公布的序列相似性为100%，即保证了标准品的稳定性，又保证了标准品同检测样品扩增效率的一致性。经反应条件优化(95℃,预变性10s;95℃变性30s,59℃,退火30s,收集荧光,循环42次)，成功地建立了优化的标准曲线。靶基因MOC1标准曲线方程为：Y=－3.509X＋43.999，其线性范围可达6个数量级，扩
Ct值和起始模板拷贝数具有良好的相关增效率高，
性。在进行样本检测时，先将mRNA逆转录成cDNA，再与标准品同时进行PCR，从而达到绝对定量目的。
分蘖是影响单产的重要农艺性状之一，是单子叶植物在生长发育过程中形成的一种特殊的分枝特性，对超高产育种和“量化理想株型”的构建具有重要意义(McSteenandLeyser,2005;WardandLeyser,2004)。本研究建立的定量体系及方法为研究这一重要农艺性状提供了可靠、准确的定量方法，如若在不同时期、植株不同部位采集样品，就可以比较容易地分析MOC1基因在水稻生长期不同时空下的表达情况，对详细认识单子叶植物分蘖现象具有重要意义，同样这一优化体系对转MOC1基因植物的检测也具有很好的应用潜力。
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