南瓜种质资源遗传多样性的SSR分析

澎江右　矸学　２０１７年第５８卷第７期　ＤＯＩ：　１０．１６１７８／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２８－９０１７．２０１７０７２１　呵　文献著录格式：王迎儿，邢乃林，应泉盛，等．南瓜种质资源遗传多样性的ＳＳＲ分析［Ｊ］．浙江农业科学，２０１７，５８（７）：１１６１．１１６５　南瓜种质资源遗传多样性的ＳＳＲ分析　王迎儿　，邢乃林　，应泉盛　，张慧波　一，黄芸萍　，王毓洪　（１．宁波市农业科学研究院蔬菜研究所，浙江宁波３１５０４０；２．浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江ｔｉｌ；＇．１＇＇ｉｌ　３１１３００）　摘　要：以主要来源于浙江省的４１份南瓜种质资源为材料，利用２６对南瓜ＳＳＲ标记对其进行遗传多样性　及亲缘关系分析。结果表明，４１份种质被分为４类，２类为白籽南瓜（各１份），１类中国南瓜（３５份），１类印　度南瓜（４份）。材料间的遗传相似系数介于０．４５～０．９６，平均为０．７９。其中，中国南瓜类群种内平均相似系数　为０．８６，印度南瓜类群种内平均相似系数为０．６７，这２个类群间的平均相似系数为０．５４。所收集的浙江省种质　资源除其中２份外，均被分类为中国南瓜，平均遗传相似系数为０．８７。中国南瓜的亲缘关系较印度南瓜近，种　内亲缘关系较种间近。研究结果对浙江省南瓜种质资源保护和开发利用具有重要意义。　关键词：南瓜；种质资源；ＳＳＲ；聚类分析；遗传相似性　中图分类号：￥６４２．１　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２８—９０１７（２０１７）０７—１１６１—０５　南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　Ｌ．）为１年生草本植物，属　高，因此，在分子水平对种质资源遗传多样性进行　评价，可靠性更高　。目前，国内外学者为了从　分子水平研究南瓜种质资源的遗传多样性，已经利　用过氧化物同工酶　、ＲＡＰＤ　、ＡＦＬＰ［　、　ＳＳＲｌｌ６＿　、于葫芦科南瓜属，在世界范围内广泛栽培。栽培种　主要分为５类，包括美洲南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ）、　中国南瓜（Ｃ．　ｍｏｓｃｈａｔａ）、印度南瓜（Ｃ．　ｍａｘｉｍａ）、黑籽南瓜（Ｃ．ｆｉｃｉｆｏｌｉａ）和灰籽南瓜　（Ｃ．ｍｉｘｔａ），用途广泛，营养丰富，变种繁多　。　南瓜起源于美洲大陆，明代由东南亚、朝鲜和日本　ＥＳＴ．ＳＳＲ　Ｅ　、ＳＲＡＰ　Ｅ　、ＩＳＳＲ　Ｅ　¨　，　等　分子标记对国内外种质资源进行栽培种内及栽培种　间的遗传多样性进行分析。但是作为南瓜在国内传　播的重要节点，浙江相关的地方种质资源少有涉　及。本研究以浙江省为主的４１份南瓜种质资源为　研究材料，利用ＳＳＲ分子标记对其进行遗传多样　等地传人我国，距今近５００多年的历史　。传人中　国后，由浙江、福建等东南沿海地区向内地扩展，　在多年栽培扩展过程中产生了丰富的表型及遗传变　异。对育种工作者而言，种质资源是品种培育的基　础，而种质资源的收集及评价分析则是种质资源利　用的必需过程，可为杂交育种中亲本选配提供依　性分析，旨在为南瓜种质资源保护及新品种选育提　供参考。　１材料与方法　１．１　材料　据，有利于优良品种的选育。地方种质资源在地区　气候环境适应性方面具有一定优势，具有丰富的生　物及非生物胁迫抗性遗传资源，适宜用作地方品种　的选育基础　。因此，开发利用地方种质资源已　成为育种的重要发展方向，对品种选育具有重要　意义。　供试材料共４１份（表１）。分别为中国南瓜、　印度南瓜、中国南瓜与印度南瓜杂交材料，主要来　源于浙江省内的农家留种，少量为其他国家和地区　引进的材料。　１．２　处理设计　遗传多样性是种质资源评价的重要指标，主要　包括表型水平和分子水平２个方面。通过ＳＳＲ等　材料于２０１６年秋季种植于宁波市农业科学研　究院宁波市高新农业技术实验园区设施大棚内，每　份材料定植１５株。开花期对每份材料随机选取　分子标记在分子水平对种质资源进行多样性评价，　相对表型水平受环境影响较小，重复性及稳定性较　２Ｏ１７－０４．２５　收稿日期：　００５３）；国家西甜瓜产业技术体系（ＣＡＲＳ－２６）；宁波市瓜菜育种重点实验室（２０１４Ａ２２００７）　基金项目：　宁波市科技富民惠民项目（２０１５Ｃ１王迎儿（１９８５一），女，浙江宁波人，农艺师，硕士，从事瓜类砧木育种工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｉｎｇｅｒ０６０１＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。　作者简介：　通信作者：　王毓洪，Ｅ・ｍａｉｌ：ｙｈｗａｎｇｓｃ＠１６３．ｃｏｒｎ。　澎江雇Ｊ－：升学　２０１　７年第５８卷第７期　表１　种质资源编号及类别　４株取幼嫩叶片，混合后进行基冈组ＤＮ　Ａ提取。　ＤＮＡ提取方法参照文献　利用超微量分光光度　计检测ＤＮＡ质量及浓度，稀释至２０　ｇ・　Ｌ　后进　行ＰＣＲ扩增～　ＳＳＲ引物序列参考文献［２３　，小研究选取其　中扩增条带清晰、稳定、多态性高的５０埘引物进　行分析，引物南上海英潍捷基生物公司合成，引物　序列见表２。ＰＣＲ扩增体系ｌ０　Ｌ：ＤＮＡ（２０　ｎｇ・　ＬＬＩ　）２　Ｌ，１０　Ｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　ｌ　Ｌ，２５　ｎｌｍｏｌ・　１　～ＭｇＣ１：０．８　Ｌ，１０　１１＂１１３１０１・Ｉ　ｄＮ一１　Ｐ　０．１　６　Ｉｘ１　，　１　０　ＩｌｌＩｎｏ｜・Ｉ　ｌｌｌｅｌ’１　ｔ＊１　，Ｔ．ｑ怖（伞武金）　０．１　ＩＬ１　，ｄｄ　Ｈ　Ｏ　４．９４　ｔｘＩ　ＰＣＲ干旱序：９４　４　ｌｌｌｉｎ：９４℃４５　Ｓ．６５　３０　ｓ（每循环降０．７　：），　７２　１　ｍｉｎ，１０个循环；　９４　４５　ｓ．５６　３０　ｓ．　７２℃１　ｌｌｌｉｎ，２５个循环；７２　：１　０　ＩＩ１＿ｌ１Ｉ　２５　：　１０　ｒａｉｎ。扩增产物川０．６％变性聚　烯酰胺凝胶进　行电泳检测，常姚硝酸银染色法银染　１．３　数据分析　为了后续ＳＳＲ分析，对每个多态性化点，ｆ¨　现及缺欠的ＰＣＲ扩增　纹分别赋值为１和０通过　ＮＴＳＹＳｐｃ　２．１０　软件进行数据分析，获得材料问的　遗传相似性及遗传距离，并进一步绘制树状聚　类图　２结果与分析　２．１　ＳＳＲ引物的筛选　利用５０对ＳＳＲ引物对收集的４ｌ份南瓜种质　材料进行分析，结果（表２）　示，２６对引物具　有多态性，多念性条带１４１条，半均５．４２条　，扩　增多态性条带最多的为标记Ｓｌ　９８，共有１　７条，　最少的为Ｓ１　２５，只有ｌ条、多态性ｆ．　息含　半均　０．５８，Ｓ１　９８的多忿性信息含　最高，为０．９１，　Ｓ３　１　２的多态性信息含量最低，为０．３２　罔ｌ为　ＳＳＲ引物￥２６４对４ｌ份南瓜种质材料的扩增电泳　图谱。　图１　４１份材料ＳＳＲ引物￥２６４的扩增结果　２．２　４１份南瓜材料的遗传相似性分析　基于ＳＳＲ数据，通过ＮＴＳＹＳｐｃ　２．１０ｔｌ统计４１　份南瓜资源的遗传相似系数。材料『廿Ｊ的遗传棚似系　数为０．４５～０．９６，平均为０．７９　其ｌ｝１　５　ｌ与５２、７９　与８４之间的遗传相似系数最大，为０．９６，表明这　２对种质资源之间的亲缘父系最近　７３与８５之　的遗传相似系数最小，为０．４５，表明这２份种质　资源问的亲缘关系最远　２．３　４】份南瓜材料的聚类分析　利川２６对ＳＳＲ引物得…的电泳谱带数据进行　聚类分析，得到聚类树状　（冈２）　０　Ｏ０　０　１　５　Ｏ　２９　相似系数　图２基于ＳＳＲ分析的４１份南瓜种质材料的聚类结果　由图２可知，在阈值为０．１３时，４１份南瓜种　质资源划分为４个类群。第１类群包括１份材料，　编号４７，为白籽南瓜；第Ⅱ类群包括４份材料　（编号７２、７３、８９、９０），为印度南瓜；第Ⅲ类群　包括３５份材料，为中国南瓜；第Ⅳ类群包括１份　材料８７，为白籽南瓜。　第１类群与第Ⅱ类群的平均相似系数为０．６１，　编号４７与９０的相似系数达０．６９，编号４７与８９的　相似系数为０．５５。第１类群与第Ⅲ类群的平均相　似系数为０．７０，编号４７与４８的相似系数达０．７７，　咽　澎江右Ｊ－：　千学　２０１７年第５８卷第７期　多样性分析，结果有２６对分子标记具有多样性。　这２６对标记平均扩增多态性条带５．４２条，高于已　知的４．１８、２．４以及２．２９　，这可能与所选择　的分子标记位点受自然及人工选择压力较小有关。　本研究所用材料有印度南瓜、中国南瓜及白籽　南瓜３类，其＿中２份白籽南瓜因为亲缘关系较远而　被分在２个类群。总体上，种间亲缘关系较种内　远，中国南瓜种内亲缘关系较印度南瓜近。这与已　发表的利用ＳＳＲ、ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ等分子标记分析结　编号４７与８３、９１的相似系数为０．６４。第１类群与　第Ⅳ类群的平均遗传相似性为０．５５。第Ⅱ类群与　第Ⅲ类群的平均相似系数为０．５４，编号５１与９０　的相似系数达０．６５，编号７３与８５的相似系数为　０．４５。第Ⅱ类群与第Ⅳ类群的平均相似系数为　０．５１，编号８７与７２的相似系数达０．５３，编号８７　与９０的相似系数为０．４９。第Ⅲ类群与第Ⅳ类群的　平均相似系数为０．６２，编号８７与５９的相似系数　达０．６８，编号８７与５３的相似系数为０．５８。第Ⅱ　类群中，编号７２与７３的遗传相似性最大为０．８２，　９０与７２、７３的遗传相似性最小为０．６２，平均为　０．６７。第Ⅲ类群的平均遗传相似性为０．８６，编号　７９与８４、５１与５２的遗传相似性最大为０．９６，编　号６３与９１的遗传相似性最小为０．７３。４７和８７这　２份白籽南瓜与印度南瓜的平均遗传相似性为　０．５６，与中国南瓜的平均遗传相似性为０．６６。２份　白籽南瓜与印度南瓜类群的遗传相似性较中国南瓜　类群低，表明所收集的２份杂交材料的中国南瓜背　景较大。中国南瓜类群内遗传相似性显著高于印度　南瓜类群。除了编号８７与印度南瓜类群外，印度　南瓜和中国南瓜类群间的遗传相似性最低，亲缘关　系最远。中国南瓜类群内的遗传相似性最高，内部　亲缘关系最远的为０．７３，最高达到０．９６；其中，　浙江省的中国南瓜材料平均相似系数为０．８７，编　号７９与８４、５１与５２的相似系数最大，均为０．９６；　６３与９１的相似系数最小，为０．７３。　３　讨论　南瓜自明代传人我国浙江和福建以来，迅速北　上南下，成为解决人民温饱的重要农作物　。因　此，收集并研究浙江地区南瓜种质资源情况对了解　我国南瓜的推广及种质资源利用和培育具有重要作　用。本研究中，浙江地区收集的种质资源主要为中　国南瓜，平均遗传相似系数为０．８７，多个地区总　体亲缘关系较近，遗传多样性不够丰富。这或许与　南瓜引入我国时间较短，自然及人为选择压力不大　有关。因此，为选育优良品种，仍需创造或引进变　异更丰富的种质资源。　ＳＳＲ分子标记因其重复性高、基因组分布及数　量丰富等优势而在种质资源评价、遗传进化、分子　育种等方面而被广泛应用　。但是在南瓜种质资　源评价中的应用还较少　。最近，超过５００对南　瓜ＳＳＲ分子标记被公布　。本研究从中随机选择　５０对ＳＳＲ分子标记对４１份南瓜种质资源进行遗传　果一致　。但与利用同工酶对南瓜亲缘关系　研究结果不一致，这可能与材料及标记的选择　有关…。　目前蔬菜种子市场混乱，具有同名异物和同物　异名现象。另外，由于农家留种大多无名称或名称　不清楚，极易造成种质资源重复收集及收集遗漏。　本研究中５１与５２、７９与８４问的遗传相似性高达　０．９６，疑为同一材料短时间内分离而来，已发表研　究也有类似结果　。７５与７６这两份来自浙江舟山　的材料虽然具有同一名字，但材料间遗传相似性为　０．８８，表明材料间具有一定程度的差异，对密本南　瓜的研究中也发现类似现象　。本研究中编号４７　的材料，因为可自交结实收种，通过外观初步归为　印度南瓜；但该材料为印度南瓜与中国南瓜的杂交　材料，虽然可白交收种，但种子量较少，结合田间　植株详细表现，最终认为该材料为种间杂交材料。　本研究利用ＳＳＲ标记对收集的南瓜种质资源　进行遗传多样性分析，进一步分析了中国南瓜、印　度南瓜及白籽南瓜３个栽培种的遗传多样性，构建　了聚类图谱。虽然本研究中印度南瓜及白籽南瓜材　料较少，但仍可以为南瓜亲本选配和品种选育提供　参考。　参考文献：　［１］　魏瑛，董秀珍．南瓜特性与种类述略［Ｊ］．北方园艺，１９９７　（６）：ｌ７－１９．　［２］　王鸣．南瓜属：多样性（ｄｉｖｅｒｓ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