超高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1

中国现代药物应用２０１４年１０月第８卷第２嘲Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｄｒａｇ　Ａｐｐｌ。０ｃｔ　２０１４，Ｖ０ｌ＿８．Ｎ０．２Ｏ　・１５・　超高效液相色　谱法测定三七ｔ中三七皂苷Ｒ　、　人参皂苷Ｒｇ　、　人参皂苷Ｒｂ　的方法研究　姜涛陈林明林岱滨　【摘要】目的建立超高效液相色谱法测定三七中三七皂苷Ｒ　、人参皂苷Ｒ　、人参皂苷Ｒｂ　含　量的方法。方法采用Ａｇｉｌｅｎｔ　１２９０型高效液相色谱仪，ＺＯＲＢＡＸ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｐｌｕｓ　Ｃｌ８（２．１×５０　ｍｍ，１．８　ｔａｍ）色　谱柱，以乙腈一水为流动相，梯度洗脱，流速为０．２２　ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长为２０３　ｎｍ，进样量为０．４　ｌｘｌ，柱温为　４０￣Ｃ。结果三七中三七皂苷Ｒ。、人参皂苷Ｒｇ　和人参皂苷Ｒｂ。在２５　ｍｉｎ内实现完全分离，峰面积在　选定的浓度范围内线性良好，方法回收率、精密度良好。结论超高效液相色谱法可以作为三七药材质　量控制的一种快速、方便、可靠的检测手段。　【关键词】超高效液相色谱法；三七；同时测定　Ｍｅｔｈｏｄ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｕｌｔｒａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｉｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒ１　ａｎｄ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　ｇｇｌ　ａｎｄ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｂ１　ｉｎ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ＪＩＡＮＧ　Ｔａｏ，ＣＨＥＮ　Ｌｉｎ－ｍｉｎｇ，ＬＩＮ　Ｄａｉ—ｂｉｎ．　Ｋａｎｇｍｅｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ。Ｊｉｅｙａｎｇ　５１５３ｏｏ。Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｉ　ａｎｄ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｇ１　ａｎｄ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｂｌ　ｉｎ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｂｙ　ｕｌｔｒａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　Ａｇｉｌｅｎｔ　１２９０　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ＺＯＲＢＡＸ　Ｅｃｉｌｐｓｅ　Ｐｌｕｓ　Ｃｌ８（２．１×５０　ｍｍ．１．８　ｒｔｍ）ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｃｏｌｕｍｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ—ｗａｔｅｒ　ａｓ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｉｎ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　０．２２０　ｍｌ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｗａｓ　２０３　ｎｍ，ｔｈｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　ｗａｓ　０．４山，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　４０　ｏＣ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｌ，ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ　Ｒｇ１　ａｎｄ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ　Ｒｂ１　ｉｎ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｉｎ　２５　ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｒａｎｇｅ：Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｎａｄ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　ｇｏｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｓ　ａｎ　ｎｅｗ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ，ｕｌｔｒａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｉｓ　ｆａｓｔ。ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｕｌｔｒａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｒｇａｐｈｙ；Ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ；Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　超高效液相色谱法（ｕｌｔｒａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａ—　人参皂苷Ｒｂ，对照品ｆ中国食品药品检定研究院，批号：　ｔｏｇｒａｐｈｙ，ＵＨＰＬＣ）是一种应用小颗粒填料和超高压输液泵的　Ｉ　１０７０４—２０１　１２２）、三七皂苷Ｒ．对照品（中国药品生物制品检　一种新的检测技术。与传统高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）相比，　定所，批号：１　１０７４５—２００４１５）；乙腈（Ｍｅｒｃｋ，批号：１６８２５３０３　１）　超高效液相色谱法具有更快的分析速度…。近几年分析者发　为色谱纯；水为Ｓａｒｔｏｉｆｕｓ超纯水；其他试剂为分析纯；三七　现超高效液相色谱法也很适用中药这一复杂体系的分析　Ｊ。　药材，经康美药业股份有限公司刘茂贵技术顾问鉴定为五加　三七来源为五加科人参属三七Ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ（Ｂｕｒｋ．）　科人参属三七。　Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ的干燥根　，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，主　２方法与结果　要治疗咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，　２．１色谱条件色谱柱：ＺＯＲＢＡＸ　Ｅｃｉｌｐｓｅ　ｐｌｕｓ　Ｃ１８，ＲＲＨＤ　跌扑肿痛　Ｊ，有“止血神药”之称。２０１０版《中华人民共　２．１×５０　ｍｍ，１．８　ｍ；流动相：乙腈（Ａ）一水（Ｂ），梯度洗脱　和国药典》ｆ以下简称《药典》）中以人参皂苷Ｒ　、人参皂　［２．４　８　ｍｉｎ，１９：８１＿＋２０：８０；８＿１２　ｍｉｎ，２０：８０—３６：６４；　苷Ｒｂ　和三七皂苷Ｒ　作为三七含量测定的指标　。但洗脱　１２　１５　ｍｉｎ．３６：６４一十３６：４６；１５＿＋１６　ｍｉｎ．３６：６４　７９：２１；　过程需要６０　ｍｉｎ，加上后平衡时间，一个样品的分析时长大　１６　２０　ｍｉｎ，７９：２１—７９：２１］；流速：０．２２０　ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：　概得７５　ｍｉｎ，耗时较长。本研究在《药典》ＨＰＬＣ条件基础上，　２０３　ｎｍ；柱温：４０￣Ｃ；进样量：０．４　。对照品及供试品色　利用ＵＨｐＬＣ建立了三七含量的快速测定方法。结果表明：　谱图见图１，图２。　与传统ＨＰＬＣ方法相比，该法具有可明显缩短分析周期、灵　敏度高和节省溶剂的的优点，有良好的应用前景。　１仪器与材料　超高效液相色谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ　１２９０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ型（包括二元泵、　自动进样器、柱温箱及二极管阵列检测器），人参皂苷Ｒｇ　对照品（中国食品药品检定研究院，批号：１　１０７０３—２０１　１２８）、　图１三七混合对照品色谱图　作者单位：５１５３００康美药业股份有限公司　注：１，２，３分别为三七皂苷Ｒ　，人参皂苷Ｒｇ　．人参皂苷Ｒｂ　・１６・　现代药物应用２０１４年１０月第８卷第２　ｉｎ』　旦　ｇ　卫Ｐ　！　！　！：　：　：　Ｒ　、人参皂苷Ｒｂ。的峰面积，并计算其相对标准偏差ＲＳＤ，　其结果分别为１．０８％、０．７１％、０．４９％，表明该方法重复性良好。　２．７稳定性试验取“２．６”项下供试品溶液，按照“２．１”　项目下的色谱条件分别于０、２、４、８、ｌ２、２０　ｈ进行测定，　记录三七皂苷Ｒ，、人参皂苷Ｒｇ　、人参皂苷Ｒｂ　的峰面积，　并计算其相对标准偏差ＲＳＤ，其结果分别为０．９８％、１．５７％、　０．３８％，表明供试品溶液在２４　ｈ内稳定性良好。　３讨论　图２三七供试品色谱图　３．１在本次试验中，三七中的三七皂苷Ｒ　、人参皂苷Ｒｇ　和　人参皂苷Ｒｂ　的色谱峰与相邻峰的分离度分别为３．６、８．７和　２．２对照品溶液的制备精密称取三七皂苷Ｒ　、人参皂苷　３．４，均符合２０１０版《中华人民共和国药典》的附录要求。与　Ｒｇ１、人参皂苷Ｒｂ。对照品适量，加甲醇制成每１毫升含三七　ＨＰＬＣ方法相比，ＵＨＰＬＣ方法明显地降低检测时间，在１３　ａｒｉｎ　皂苷Ｒ。０．１　ｍｇ、人参皂苷Ｒｇｌ　０．３　ｍｇ、人参皂苷Ｒｂ。０．４　ｍｇ　内即可将三七中的三七皂苷Ｒ　、人参皂苷Ｒｇ。和人参皂苷　的混合溶液，摇匀，０．２２　ｇｍ滤过，取续滤液，即得。　注：１，２，３分别为三七皂苷Ｒ。，人参皂苷Ｒｇ¨人参皂苷Ｒｂ，　Ｒｂ　三种待测成分完全分离。　精密称取三七粉末（过四号筛）０．６　３．２相对ＨＰＬＣ常用５　ｍ粒径的填料，ＵＨＰＬＣ使用的１．８　ｍ　ｇ，精密称定，精密加入甲醇５０ｍｌ，称定重量，放置过夜，置　的填料粒径更小，根据范德米特（ｖａｎ　Ｄｅｅｍｅｔｅｒ）方程，小粒径　８０％水浴上保持微沸２　ｈ，放冷，再称定重量，用甲醇补足减　填料可得到更佳的柱效，可缩短分析时间。另外，选用２．１　ｍｍ　失的重量，摇匀，０．２２　ｇｍ滤过，取续滤液，即得。　内径的色谱柱，可有效减少溶剂扩散效应，达到高分离效率　２．４线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液０．２、０．３、　的需求。但由于整柱体积比以往色谱柱小，分析复杂样品时　更容易出现堵塞现象，故在１５　ｍｉｎ后用高强度有机相冲洗以　防止柱堵塞现象。　３供试品溶液的制备０．４、０．５、０．６　，注入超高效液相色谱仪，以色谱峰峰面积（Ｙ）　为纵坐标，对照品进样量（ｘ）为横坐标绘制标准曲线，得到人　参皂苷Ｒｇ。、人参皂苷Ｒｂ　和三七皂苷Ｒ。三种成分的回归方　程。三七皂苷Ｒ　的回归方程为Ｙ－－７２９２．６Ｘ一２０．３８０（ｒ＝０．９９９９），　综上所述，采用超高效液相色谱法测定三七中人参皂苷　线性范围为０．０２１６～０．０６４８　；人参皂苷Ｒｇ】的回归方程为　Ｙ＝７８０６．７Ｘ－５０．８２０（ｒ＝０．９９９８），线性范围为０．０６０６～０．１８１９　；　人参皂苷Ｒｂ　的回归方程为Ｙ＝６９７０．８　４３．８１０（ｒ＝０．９９９９），线　Ｒ　、人参皂苷Ｒｂ　和三七皂苷Ｒ　的含量，大大降低了三七　含量测定时间，提高了工作效率，可以作为三七药材质量控　制的一种快速、方便、可靠的检测手段。　参考文献　性范围为０．０８１９—０．２４５８　。表明该方法线性关系良好。　２．５准确度试验精密称取已知含量的三七药材粉末６份，　每份约０．４　ｇ，精密称定，置于２５０　ｍｌ具塞锥形瓶中，精密加　入混合对照品溶液２０　ｍｌ，按“２．３”项目下的方法制备供试品　［１］　杨乔森．超高效液相色谱的特点分析及在药物领域的应用．中　国石油和化工标准与质量，２０１２，３３（１０）：２３０．　［２］金高娃，章飞芳，薛兴亚，等．超高效液相色谱在复杂体系中　药分离分析中的应用．世界科学技术一中医药现代化，２００６，　８（３）：１０６—１　１　１．　溶液，依“２．１”法测定，计算三个组分回收率，平均回收率　如下：三七皂苷Ｒ　为１０１．１９％，ＲＳＤ为２．９％，人参皂苷Ｒ蜀为　１　１８．０２％，ＲＳＤ为０．９％，人参皂苷Ｒｂ１为９９．７３％，ＲＳＤ为０．９％。　表明该方法准确度良好。　［３］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）．北京：化学工　业出版社，２０１０：１１－１２．　１７—２２．　２．６精密度试验　精密称取三七药材粉末０．６　ｇ，按“２．３”　［４］肖培根．新编中药志．第１卷．北京：化学工业出版社，２００１：［收稿日期：２０１４—０８—１１］　项目下进行处理得供试品溶液，平行操作６份，按照“２．１”　项目下的色谱条件进行测定，记录三七皂苷Ｒ　、人参皂苷