(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105263947 A (43)申请公布日 2016.01.20
(21)申请号 201480031532.X(22)申请日 2014.06.25(30)优先权数据
2145/MUM/2013 2013.06.25 IN(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.12.01
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/IN2014/000421 2014.06.25(87)PCT国际申请的公布数据
WO2014/207763 EN 2014.12.31(71)申请人卡迪拉保健有限公司
地址印度古吉拉特(72)发明人桑吉乌·库马尔·门迪拉塔
桑贾伊·班迪奥帕迪亚伊阿万尼什·库马尔·辛格(74)专利代理机构北京康信知识产权代理有限
责任公司 11240
代理人张英 宫传芝
权利要求书3页 说明书8页 附图7页
(51)Int.Cl.
C07K 1/36(2006.01)C07K 16/00(2006.01)
(54)发明名称
单克隆抗体的纯化工艺(57)摘要
本发明提供了一种从细胞培养物中纯化单克隆抗体的改善方法。期望单克隆抗体的纯化方法包括亲合层析、疏水相互作用层析和可选的离子交换柱层析。其提供大于99％纯度的期望单克隆抗体。
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权 利 要 求 书
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1.一种用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的方法，包括以下顺次的步骤：
(a)亲合层析，
(b)疏水相互作用层析，可选的随后的其它合适的纯化步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中亲和层析基质选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。3.根据权利要求1所述的方法，其中亲和层析基质是蛋白A。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括：在用于结合的合适pH和/或电导系数，将含有期望抗体的粗制混合物加载至柱，随后在所述期望抗体以单峰形式洗脱之前进行柱冲洗。
5.根据权利要求4所述的方法，其中柱冲洗包括：
(i)在合适的pH和/或电导率利用平衡缓冲液的第一冲洗，
(ii)在与所述第一冲洗缓冲液相同的pH和/或比所述第一冲洗缓冲液更高的电导率的第二冲洗，
(iii)在低于所述第二冲洗缓冲液的pH和/或电导率的第三冲洗，
(iv)在比所述第三冲洗缓冲液更低的pH和/或更高的电导率的抗体洗脱。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述柱冲洗包括：
(i)在约pH 7.4和/或在1mS/cm至30mS/cm范围内的电导率利用平衡缓冲液的第一冲洗，
(ii)在约pH 7.4和/或大于30mS/cm的电导率的第二冲洗，
(iii)在pH 5至pH 6.5范围内的pH和/或在1mS/cm至5mS/cm范围内的电导率的第三冲洗，
(iv)在约pH 3.5和/或高于5mS/cm的电导率的抗体洗脱。7.根据权利要求5所述的方法，其中缓冲液组分选自Tris、醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液。8.根据权利要求5所述的方法，其中在范围从约pH 3.5至pH 4、优选3.5至3.7的pH进行抗体洗脱。
9.根据权利要求5所述的方法，其中在所述缓冲液中利用添加剂进行洗脱，所述添加剂如氯化钠、精氨酸、甘氨酸，优选氯化钠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之后的抗体制剂中聚集体的量不大于5％，优选不大于2％。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在pH 5至pH 7范围内的pH和/或大于100mS/cm的电导率进行步骤(b)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中利用梯度降低的盐浓度从柱中洗脱抗体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中盐选自硫酸铵、氯化钠、氯化铵和硫酸钠，优选硫酸铵。
14.根据权利要求1所述的方法，其中疏水柱基质选自苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，优选苯基琼脂糖凝胶。
15.一种用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的方法，包括以下步骤：(a)蛋白A亲和层析(b)疏水相互作用层析
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权 利 要 求 书
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(c)离子交换层析
其中步骤(b)和步骤(c)可以以任何顺序进行。16.根据权利要求15所述的方法，其中根据权利要求2-10所述进行步骤(a)。17.根据权利要求15所述的方法，其中根据权利要求11-13所述进行步骤(b)。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述离子交换层析选自阳离子交换层析和阴离子交换层析。
19.根据权利要求18所述的方法，其中离子交换层析是阴离子交换层析。20.根据权利要求15所述的方法，其中用于阴离子交换层析的柱基质选自DEAE琼脂糖凝胶、Mono Q和Q琼脂糖凝胶XL。
21.根据权利要求20所述的方法，其中柱基质是Q琼脂糖凝胶。22.根据权利要求15所述的方法，其中以流动-通过-和-冲洗模式或结合-洗脱模式进行在步骤(c)的抗体洗脱。
23.一种用于从细胞培养物中纯化单克隆抗体的方法，包括：a)细胞分离b)蛋白A层析c)低pH温育d)中和和再调节e)疏水相互作用层析f)超滤-渗滤g)阴离子交换层析h)纳滤
i)超滤-渗滤j)微滤
其中步骤(e)至(j)可以以任何顺序进行。24.根据权利要求23所述的方法，其中根据权利要求2-9所述进行步骤(a)。25.根据权利要求23所述的方法，其中根据权利要求10-12所述进行步骤(b)。26.根据权利要求23所述的方法，其中渗滤介质选自磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和它们的组合。
27.根据权利要求1-26所述的方法，其中利用选自以下的缓冲液组分从柱中回收抗体：柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐，优选柠檬酸盐。
28.根据权利要求1-26所述的方法，其中利用选自以下的添加剂从柱中回收抗体：氯化钠、精氨酸、甘氨酸，优选氯化钠。
29.根据权利要求1-28所述的方法，其中在pH 5至pH 7范围内的pH、优选在pH 6.5进行抗体洗脱。
30.根据权利要求1-29所述的方法，其中抗体的总回收率在不小于50％的初始量范围内，优选地在不小于70％的初始量范围内，更优选地在85％至90％的初始量范围内。
31.根据权利要求1-30所述的方法，其中纯化抗体制剂含有不大于1％的聚集体。32.根据权利要求1-31所述的方法，其中抗体选自抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗CD52抗体、抗RANKL、抗IgE抗体。
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权 利 要 求 书
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33.根据权利要求1-32所述的方法，其中抗体选自曲妥单抗、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、贝伐单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、贝妥莫单抗、依帕珠单抗。
34.根据权利要求1-33所述的方法，其中抗体是阿达木单抗、曲妥单抗和利妥昔单抗。
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说 明 书单克隆抗体的纯化工艺
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技术领域
本发明提供了一种从细胞培养物中纯化单克隆抗体的改善方法。期望的单克隆抗体纯化工艺包括亲合层析、疏水相互作用层析和可选的离子交换柱层析。其提供大于99％纯度的期望的单克隆抗体。
[0001]
背景技术
从细胞培养基中纯化药物级单克隆抗体蛋白质包括收获/净化
(clarification)，接着通过使用一系列的柱层析步骤与膜超滤和渗滤结合而纯化。在纯化之后，期望的抗体制剂经适当配制并且存储在合适的条件中。然而，很多时候，这些步骤无法提供具有其药物应用所需的期望水平的纯度和质量的抗体。有时，在柱纯化期间，观察到工艺相关的和产物相关的杂质与期望的抗体一起共洗脱。因此，从期望的制剂中减少或去除这样的杂质是重要的。此外，蛋白质聚集(团聚，aggregation)是在单克隆抗体(mAb)生产期间主要关心的问题。聚集体的存在可以降低单克隆抗体的疗效并且已知在人类中引发免疫原应答(immunogenic responses)。因此，在下游纯化期间，主要通过柱层析从单克隆抗体期望的制剂中去除聚集体是必须的。为了解决此问题，本发明提供了纯化抗体的新方法，其有助于以特定的方式通过使用一系列的柱层析从含有感兴趣的抗体的无细胞培养基中去除连同高分子量聚集体的工艺-和产物-相关的杂质达到期望的水平。在本发明中，所述纯化抗体的工艺以直截了当的方式证实良好控制的纯化工艺产生具有大于80％的回收率的高纯度抗体制剂。在本发明中，高纯度抗体制剂是指至少有99％的纯度和基本上无工艺和产物相关的杂质和基本上没有高分子量蛋白质聚集体的抗体制剂。此外，本发明提供了一种高度可放大的(scalable)和可重复的纯化单克隆抗体工艺。就工艺经济性和工业生存性而言，所描述的新纯化工艺提供了一个用于纯化不同的治疗用途的抗体的公用平台。
[0003] 这样的技术中的一些在以下专利中公开：
[0004] US 6417335公开了从包含抗体和污染物的组合物中纯化抗体的方法，所述方法包括：(a)加载该组合物至阳离子交换树脂上，其中在阳离子交换树脂上加载的抗体的量是每mL阳离子交换树脂约20mg至约35mg的抗体；以及(b)从该阳离子交换树脂洗脱抗体。[0005] US 7863426描述了从包含抗体和至少一种HCP的混合物中生产宿主细胞蛋白质(HCP)减少的抗体制剂的方法，包括离子交换分离步骤，其中混合物易受到第一离子交换材料的影响，使得获得HCP减少的抗体制剂。
[0006] 本发明领域的其它相关专利是US 6489447 EP 1075488；EP1308455；EP1308456B等等。通过引用将上述中的每一个的全部内容结合于此。
[0007] 本发明提供了一种通过以独特的方式采用常规柱层析技术从而获得高纯度的期望抗体制剂同时去除工艺-和产物-相关的杂质(特别是蛋白质聚集体)的新抗体纯化工艺。我们在此公开了这样的纯化工艺。
[0002]
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发明内容
本发明提供了一种源自细胞培养物的粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法。[0009] 在一个方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括一系列柱层析和超滤-渗滤步骤。[0010] 在另一个方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括使用蛋白A亲和层析与疏水相互作用层析步骤。蛋白G或蛋白L在亲合层析步骤中可用作为柱基质(matrix)。[0011] 在其它方面中，蛋白A亲和层析步骤包括在用于结合的合适pH和/或电导系数(conductance)下，将含有期望抗体的粗制混合物加载至柱，接着在期望抗体以单峰形式洗脱之前进行柱冲洗。
[0012] 在另一个方面中，根据本发明的方法包括三个柱冲洗步骤，其中(i)利用平衡缓冲液的第一冲洗，(ii)在与第一冲洗缓冲液相同的pH和/或比第一冲洗缓冲液更高的电导率(conductivity)下的第二冲洗，(iii)在低于第二冲洗的pH和/或电导率下的第三冲洗，(iv)在比第三冲洗更低的pH和/或更高的电导率下洗脱抗体。[0013] 在另一个方面中，利用梯度降低(down-the-gradient)的盐浓度进行根据本发明的疏水相互作用层析。
[0014] 在进一步的方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括蛋白A层析、疏水相互作用层析和离子交换柱层析。[0015] 在又一个方面中，本发明提供了一种从粗制混合物中纯化单克隆抗体的方法，其包括与用于再调节(reconditioning)蛋白溶液的超滤-渗滤相结合的蛋白A层析、疏水相互作用层析和离子交换柱层析。此处术语蛋白溶液是指污染蛋白质和期望抗体的混合物或者通过本文所述的方法获得的相对纯的期望抗体制剂。[0016] 在其它方面中，根据本发明的离子交换层析选自阳离子交换层析和阴离子交换层析，优选阴离子交换层析。
[0017] 在优选的实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体的纯化方法，包括以下步骤：
[0018] 1.蛋白A层析
[0019] 2.疏水相互作用层析[0020] 3.阴离子交换层析
[0021] 可以以任何次序进行疏水相互作用层析和离子交换层析步骤。
[0022] 蛋白A柱步骤可用于从粗制混合物中捕获单克隆抗体并可用于以结合-洗脱模式从柱中洗脱具有高纯度水平的期望的单克隆抗体。疏水相互作用层析步骤用于以结合-洗脱模式进一步去除工艺-和产物-相关的杂质。采用阴离子交换层析用于以流动-通过模式进一步去除工艺-相关的杂质。[0023] 在一个方面中，可以根据本发明纯化的抗体包括抗HER2抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗CD52、抗RANKL、抗IgE抗体等。
[0008]
在其它方面中，本发明提供了一种在蛋白A亲和层析步骤之后具有不大于5％的聚集体的量的抗体制剂。[0025] 在另一个方面中，本发明提供了一种具有不大于1％，更优选不大于0.5％的聚集
[0024]
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体的量的抗体制剂。
[0026] 在本说明书中使用的缩写定义如下：[0027] 蛋白A：蛋白A交联的琼脂糖凝胶柱。[0028] HIC：疏水相互作用柱层析。[0029] AEX：阴离子交换柱层析。
[0030] HP-SEC：高效-体积排阻层析(high-perfomance-size exclusion chromatography)。[0031] MWCO：分子量截留。[0032] NaCl：氯化钠。[0033] WFI：注射用水。附图说明
图1示出了通过蛋白A亲合柱层析的阿达木单抗(adalimumab)的洗脱曲线。[0035] 图2示出了通过分析HP-体积排阻层析(HP-SEC)的蛋白A亲合纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在第一次柱纯化之后实现了阿达木单抗的纯度大于99％。[0036] 图3示出了通过疏水相互作用柱层析的阿达木单抗的洗脱曲线。
[0037] 图4示出了通过分析HP-体积排阻层析(HP-SEC)的HIC纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在第二次柱纯化之后实现了阿达木单抗的纯度大于99％。[0038] 图5示出了阿达木单抗的阴离子交换柱层析曲线。
[0039] 图6示出了通过分析HP-体积排阻层析(HP-SEC)的AEX柱纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在AEX柱纯化之后实现了阿达木单抗的纯度大于99％。
[0040] 图7示出了通过分析HP-体积排阻层析(HP-SEC)的纯化的阿达木单抗的纯度。该图示出了在最终制剂中在纯化结束时实现了阿达木单抗的纯度大于99％。
[0041] 图8示出了通过分析HP-体积排阻层析(HP-SEC)的HIC纯化的利妥昔单抗(rituximab)的纯度。该图示出了在第二次柱纯化之后实现了利妥昔单抗的纯度大于99％。
[0042] 图9示出了通过分析HP-体积排阻层析(HP-SEC)的HIC纯化的曲妥单抗(trastuzumab)的纯度。该图示出了在第二次柱纯化之后实现了曲妥单抗的纯度大于99％。
[0034]
具体实施方式
[0043] 本发明描述了通过使用一系列柱层析步骤纯化源自细胞培养物的单克隆抗体的方法，包括与超滤和渗滤相结合的亲和柱层析、疏水相互作用柱层析和离子交换柱层析。[0044] 在一种实施方式中，本发明提供了一种通过使用蛋白A柱层析首先捕获，随后可选地在添加剂/盐存在下在低pH从柱中洗脱具有高纯度水平的蛋白质而从粗制混合物纯化源自细胞培养物的单克隆抗体的方法。粗制混合物可以包括宿主细胞衍生的污染蛋白质、产物有关的物质和除感兴趣的蛋白之外的其它杂质。在亲合层析步骤中，蛋白G或蛋白L可用作柱基质。
[0045] 在另一种实施方式中，根据本发明的方法包括三个柱冲洗步骤，其中(i)利用平
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衡缓冲液的第一冲洗，(ii)在与第一冲洗缓冲液相同的pH和/或比第一冲洗缓冲液更高的电导率下的第二冲洗，(iii)在低于第二冲洗的pH和/或电导率下的第三冲洗，(iv)在比第三冲洗更低的pH和/或更高的电导率下抗体的洗脱。[0046] 在优选的实施方式中，根据本发明的柱冲洗步骤包括：(i)在约pH 7.4和/或在约20mS/cm，优选地在1mS/cm至30mS/cm范围内的电导率下利用平衡缓冲液的第一冲洗，(ii)在约pH 7.4和/或大于20mS/cm的电导率下的第二冲洗，(iii)在比pH 7.4更低，优选地在pH 5至pH 6.5范围内的pH和/或小于20mS/cm，优选地在1mS/cm至5mS/cm范围内的电导率下的第三冲洗，(iv)在约pH 3.5和/或高于5mS/cm的电导率下抗体的洗脱。[0047] 在一种实施方式中，用于蛋白A层析纯化步骤的缓冲液组分选自Tris、醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液。
[0048] 在优选的实施方式中，在范围从约pH 3.5至4，优选地3.5至3.7的pH进行根据本发明的抗体洗脱。
[0049] 在一种实施方式中，根据本发明的方法包括选自氯化钠、精氨酸、甘氨酸的添加剂/盐，优选氯化钠。
[0050] 本发明还证实了通过蛋白A柱层析去除大部分宿主细胞污染蛋白质，同时在盐存在下在低缓冲液pH条件下以最大回收率将感兴趣的蛋白质洗脱出柱。[0051] 在一种实施方式中，本发明还证实了在从蛋白A柱洗脱之后期望的单克隆抗体的分子完整性，在酸性pH值条件下保持不变至少约1小时，如同通过分析HP-SEC评估的。[0052] 在另一种实施方式中，本发明提供了以结合-洗脱模式使用疏水相互作用柱层析从期望的蛋白质部分中去除残留的工艺-相关的和产物-相关的杂质。利用梯度降低的盐浓度进行主峰形式的期望蛋白质的洗脱。[0053] 在其它实施方式中，用于疏水相互作用层析的柱基质选自苯基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，优选苯基琼脂糖凝胶。[0054] 在此外的实施方式中，在疏水相互作用层析步骤用于洗脱期望蛋白质的盐选自硫酸铵、氯化钠、氯化铵和硫酸钠，优选硫酸铵。[0055] 在另一种实施方式中，在pH 5至pH 7范围内的pH和/或大于100mS/cm的电导率下进行疏水相互作用层析。[0056] 在一种实施方式中，根据本发明的离子交换层析选自阳离子交换层析和阴离子交换层析，优选阴离子交换层析。[0057] 在另一种实施方式中，用于阴离子交换层析步骤的柱基质选自DEAE琼脂糖凝胶、Mono Q和Q琼脂糖凝胶XL，优选Q琼脂糖凝胶。[0058] 在一种实施方式中，本发明也示出了以通过阴离子交换柱层析的流动-通过-和-冲洗模式或通过阳离子交换层析的结合-洗脱模式纯化期望的单克隆抗体。[0059] 在优选的实施方式中，源自细胞培养物的期望单克隆抗体的纯化以如下方式进行：
[0060] 1.蛋白A层析
2.疏水相互作用层析
[0062] 3.阴离子交换层析
[0063] 在蛋白A柱层析步骤之后，可以以任何次序进行疏水和阴离子交换层析步骤。
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在优选的实施方式中，源自细胞培养物的期望单克隆抗体的纯化如下进行-[0065] 1.蛋白A层析[0066] 2.低pH温育[0067] 3.中和和再调节[0068] 4.疏水相互作用层析[0069] 5.超滤-渗滤[0070] 6.阴离子交换层析[0071] 7.纳滤
[0072] 8.超滤-渗滤[0073] 其中，在蛋白A层析步骤之后，可以以任何次序进行疏水层析、超滤-渗滤和阴离子交换层析步骤。
[0074] 在进一步的实施方式中，渗滤介质选自水、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和它们的组合。[0075] 在一种实施方式中，根据本发明，利用选自氯化钠、精氨酸、甘氨酸，优选氯化钠的添加剂/盐进行从柱中回收抗体。[0076] 在一种实施方式中，根据本发明的抗体的总回收率在不小于50％的初始量范围内，优选在不小于70％的初始量范围内，更优选在85％至90％的初始量范围内。[0077] 在优选的实施方式中，抗体选自抗HER抗体、抗TNF抗体、抗VEGF抗体、抗CD20抗体、抗CD52抗体、抗RANKL、抗IgE抗体等。[0078] 在更优选的实施方案中，抗体选自曲妥单抗、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗、贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranizumab)、利妥昔单抗、贝妥莫单抗(bectumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)等。[0079] 在其它实施方式中，本发明在蛋白A亲和层析步骤之后提供了具有不大于5％，优选不大于2％的聚集体的量的纯化抗体制剂。[0080] 在另一种实施方式中，本发明提供了具有不大于1％，更优选不大于0.5％的聚集体的量的抗体制剂。
[0081] 期望单克隆抗体的纯化工艺包括以下步骤—
[0082] -通过离心过滤和深层过滤随后再调节进行细胞分离和净化培养物上清液[0083] -蛋白A柱层析[0084] -低pH温育[0085] -中和和再调节
[0086] -疏水相互作用柱层析[0087] -超滤-渗滤
[0088] -阴离子交换柱层析[0089] -纳滤
[0090] -超滤-渗滤
-微滤
[0092] 根据本发明的纯化步骤在下面进一步详细描述：[0093] I)蛋白A柱层析：[0091]
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在接近于中性的pH，将含有期望单克隆抗体和其它污染物的源自细胞培养物的澄清上清液加载至利用合适的缓冲液平衡的蛋白A柱上。期望的单克隆抗体结合至亲和基质，而大多数污染物以流动-通过离开柱。在洗脱期望的蛋白质之前，利用多个冲洗步骤冲洗柱。在利用相同的平衡缓冲液完成柱加载之后，进行第一冲洗。利用具有比第一冲洗缓冲液更高的电导率和相同的pH的缓冲液进行第二冲洗。在与第一和第二冲洗步骤不同的pH和电导率缓冲液下进行第三冲洗。在比第三冲洗步骤更低的pH，但是更高的电导率下进行期望蛋白质的洗脱。最后，利用碱性溶液进行柱清洗。[0095] II)疏水相互作用柱层析：[0096] 以结合-洗脱模式，通过疏水相互作用柱层析进行从含有至少一种不期望的污染物的混合物中纯化期望的单克隆抗体蛋白质。在完成蛋白质-加载至柱上之后，利用梯度降低的盐浓度，即利用与平衡缓冲液电导率相比降低的电导率，从柱中洗脱期望的单克隆抗体。期望单克隆抗体蛋白的洗脱以单一宽峰的形式产生。以部分收集洗脱的蛋白质并且将含有期望纯度水平的部分汇集(pool)在一起。[0097] III)阴离子交换柱层析：[0098] 再调节含有期望单克隆抗体的蛋白质溶液以基本上与阴离子交换柱平衡条件的pH和电导率相匹配。利用pH约6.5的缓冲液平衡柱。在流动-通过-和-冲洗部分中，从柱中回收期望的蛋白质。为了进行根据本发明的阴离子交换层析，也可以使用的其它阳离子交换剂选自DEAE琼脂糖凝胶、Mono Q、Q琼脂糖凝胶XL等。阴离子交换剂Q琼脂糖凝胶已在本发明中使用。[0099] 分析技术：在300mM NaCl存在下，通过使用利用pH 6.8的磷酸钠缓冲液平衡的TSK-3000柱，进行分析体积排阻层析(HP-SEC)。以0.5mL/min的等度-模式(isocratic-mode)洗脱蛋白质。[0100] 实施例[0101] 在这里，利用以下非限制性实施例示出了本发明，这些非限制性实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围：[0102] 实施例1：纯化阿达木单抗(抗TNFα抗体)[0103] 步骤1：细胞分离/净化/再调节[0104] 在批次收获后，为了获得含有感兴趣的蛋白质连同其它可溶污染物的澄清上清液，首先通过离心过滤接着深层过滤，从培养物肉汤中分离细胞。以10,000g×30分钟进行离心过滤。通过使用0.45→0.22μm膜进行深层过滤。再调节净化上清液的pH和电导率从而配合蛋白A柱平衡缓冲液条件。[0105] 步骤2：蛋白A柱层析
[0106] 通过亲和基质接着在低pH从柱中洗脱阿达木单抗，将再调节后的净化上清液通过蛋白A亲合柱从而捕获阿达木单抗。在加载之前，在10-25mS/cm范围内的电导系数下，利用pH 7.4的合适缓冲液平衡柱。在加载之后，利用相同的缓冲液(第一冲洗)冲洗柱。第一冲洗步骤之后，利用pH 7.4的相同缓冲液但是在更高的电导系数(>25mS/cm)冲洗柱。利用具有在1-5mS/cm范围内的电导系数的pH 5.5的合适缓冲液进行第三冲洗步骤。在第三冲洗步骤之后，期望蛋白质阿达木单抗的洗脱如在图1中所示的，在大于5mS/cm的电导系数利用pH 3.5-3.7的合适缓冲液进行。当通过在图2中示出的分析HP-SEC分析时，在
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此步骤之后洗脱的阿达木单抗示出了至少98％的纯度。[0107] 步骤3：低pH温育[0108] 在室温条件下，在相同的洗脱pH条件下温育蛋白A柱洗脱的期望蛋白质部分约45-60分钟以使病毒失活，在这之后将蛋白质溶液通过0.22μm的过滤器。[0109] 步骤4：中和和再调节[0110] 低pH处理之后，以受控方式利用添加碱性溶液进行中和步骤。使用30kDa MWCO膜过滤器通过UF/DF调整pH和电导系数而再调节蛋白质溶液，从而与接下来的柱平衡条件相匹配。对于电导系数的调整，添加浓硫酸铵溶液至蛋白质溶液。在再调节之后，将蛋白溶液通过0.22μm的膜过滤器并加载在疏水相互作用柱上。[0111] 步骤5：疏水相互作用柱层析[0112] 在再调节之后，为了进一步纯化，以结合-洗脱模式将含有阿达木单抗的蛋白质溶液通过疏水相互作用层析基质苯基琼脂糖凝胶。利用具有大于90mS/cm的电导系数的pH约6.5至pH 7.0的合适缓冲液平衡柱。在结合至柱基质之后，如图3所示，利用降低的盐梯度在相同的缓冲液中从柱中洗脱阿达木单抗。如通过在图4中示出的HP-SEC所评估的，在此柱步骤之后，实现了阿达木单抗大于99％的纯度。[0113] 步骤6：超滤-渗滤(UF/DF)
[0114] 为了匹配下一个柱(Q柱)步骤的平衡缓冲液条件(例如pH和电导系数)，针对pH 6.5的低离子强度柠檬酸Na缓冲液溶液，使用30kDa MWCO膜过滤器，基本上通过UF/DF再调节疏水柱洗脱的汇集部分。将渗滤的蛋白质溶液通过0.22μm过滤器并加载至Q-柱上。
[0115] 步骤7：阴离子交换柱层析[0116] 如在图5中所示的，在低于10mS/cm的电导系数，利用pH 6.5的合适的缓冲液将含有期望单克隆抗体的经渗滤的蛋白质溶液以流动-通过-和-冲洗的模式通过Q-琼脂糖凝胶柱。在Q-柱步骤之后，正如通过在图6中示出的HP-SEC所评估的，观察到阿达木单抗的纯度是>99％。[0117] 步骤8：纳滤
[0118] 在Q-柱步骤之后，含有期望单克隆抗体的蛋白质溶液经受纳滤步骤。在纳滤之后，观察到阿达木单抗的纯度保持为大于99％。[0119] 步骤9：超滤-渗滤[0120] 在纳滤之后，为了制备本体(块状，bulk)药物物质，利用期望的媒介渗滤蛋白质溶液。
[0121] 步骤10：微滤[0122] 最后，将含有期望单克隆抗体的纯化制剂无菌地通过0.22μm的膜滤器，并且以液体形式，在冰冷条件下或在冻结条件下储存。在最终制剂中的蛋白质浓度可以从1mg/mL改变至60mg/mL。正如通过在图7中示出的HP-SEC所评估的，最终的纯化单克隆抗体阿达木单抗示出大于99％的纯度。
实施例2：纯化利妥昔单抗(抗CD20抗体)
[0124] 以在实施例1中描述的方式进行抗CD20抗体利妥昔单抗的纯化工艺。正如通过在图8中示出的HP-SEC所评估的，最终的纯化单克隆抗体示出大于99％的纯度。
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实施例3：纯化曲妥单抗(抗HER2抗体)
[0126] 以在实施例1中描述的方式进行抗HER2抗体曲妥单抗的纯化工艺。正如通过在图9中示出的HP-SEC所评估的，最终的纯化单克隆抗体示出大于99％的纯度。[0127] 纯化的制剂随后可以适当地配制为用于人类应用的药用物质。
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图1
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图2
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图3
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图4
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图5
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图7
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图8
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