Exendin_4结构的稳定性及其微球制备

文章编号1004-5503（2009）10-0993-05

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【治疗制品】Exendin-4结构的稳定性及其微球制备

艾国

单成启

程远国

【摘要】目的分析影响Exendin-4二级结构稳定性的各种因素，并制备Exendin-4微球。方法利用远紫外圆二色光谱CD）技术，分析pH值、温度、高速搅拌、油水界面对Exendin-4二级结构的影响及冰浴和蛋白质保护剂对其（Circulardichroism，

选用乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为成球材料，采用复乳法（W／O／W）制备Exendin-4微二级结构的保护作用。在此基础上，

球，并对其理化性质进行评价。结果优化了实现Exendin-4二级结构稳定性的药剂学方法。制备的Exendin-4微球流动性良好，球形圆整，平均粒径为（25.3±3.2）μm，结构保持完好，微球的载药量约为1.0%，包封率为72.3%±2.4%，微球的释药曲线符合Higuchi释放模型，未发生明显的突释，具有良好的缓释效果。结论采取适当的药剂学方法，可以保证Exendin-4结构的稳定性并制备出理化性质合格的微球。

【关键词】Exendin-4；二级结构；稳定性；圆二色光谱；乳酸-羟基乙酸共聚物；微球

StabilityofExendin-4StructureandPreparationofExendin-4Microspheres

AIGuo,SHANCheng-qi,CHENGYuan-guo,etal（InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMil－itaryMedicalSciences,Beijing100071,China）

【Abstract】ObjectiveToanalyzevariousfactorsinfluencingthestabilityofsecondarystructureofExendin-4andprepareEx－endin-4microspheres.Methods

TheinfluenceofpHvalue,temperature,high-speedhomogenizationandoil-waterinterfaceonthe

secondarystructureofExendin-4aswellasprotectiveeffectoficebathandproteinstabilizeronthestructurewerestudiedbyfarul－travioletcirculardichroism（CD）technique,basedonwhichExendin-4microsphereswerepreparedwithPLGAbyW／O／Wmethodandevaluatedforphysico-chemicalproperty.Results

ThepharmaceuticalmethodforstabilizingthesecondarystructureofExendin-4wasoptimized.ThepreparedExendin-4microspheresshowedgoodfluidity,regularshapeandintactstructure,atameansizeof（25.3±3.2）μm.Thedrug-loadingandencapsulationefficiencyofthemicrosphereswereabout1.0%and72.3%±2.4%re－spectively.ThereleasecurveofpreparedmicrosphereswasinaHiguchimode,andnoburstreleasewasobserved,indicatingthatthemicrosphereswerecontrolled-released.ConclusionThestabilityofstructureofExendin-4waskeptbyanappropriatepharmaceuti－calmethod,andExendin-4microspheresqualifiedinphysico-chemicaltestswereprepared.

【Keywords】Exendin-4;Secondarystructure;Stability;Circulardichroism（CD）;PLGA;Microspheres

Exendin-4是一种含有39个氨基酸的人胰高血糖素样多肽-1（Glucagon-likepeptide-1，GLP-1）类似物，其结构与GLP-1有53%的同源性，且其N-端不被二肽基肽酶-IV（Dipeptidylpeptidase-IV，DPP-IV）分解，因此血浆半衰期（t1／2）更长，稳定性更高，药效作用更好［1~3］。研究表明，Exendin-4具有促进胰岛素分泌，延迟胃排空、降低食欲，减少食物摄取，保护β细胞并刺激其增生等作用［4］。美国EliLilly公司和AmylinPharmaceuticals公司在体外大量合成了Exendin-4，并将其命名为Exenatide（醋酸艾塞那肽）。2005年4月，美国食品药品管理局批准Exe－natide（Byetta誖）在美国上市，用于使用二甲双胍、磺脲类药物不能理想控制血糖的Ⅱ型糖尿病患者的治疗［5］。

作者单位：军事医学科学院微生物流行病研究所药物代谢动力学实验室（北京100071）.通讯作者：程远国，E-mail：chengyg@nic.bmi.ac.cn

Exendin-4相对于现有药物，虽然具有不可比拟的优越性，但由于肽类化合物的特点，使其仍需每天2次注射给药，且治疗费用昂贵，为此，我们开展了Exendin-4微球注射剂的研究。在微球的制备过程超声、使用有机溶剂及冷冻干燥等，这中，需要搅拌、些外界因素的干扰均可能导致药物的理化性质发生

7］

改变，影响蛋白质的结构，而使其部分或完全失活［6，。

同时，微球在体外释放过程中，释放介质的温度、pH值等也可能影响Exendin-4的稳定性［6］。为此，我们在开展Exendin-4微球制剂研究前，首先利用远紫外圆二色光谱（Circulardichroism，CD）分析了在微球制备和释放过程中，不稳定因素对Exendin-4二级结构的影响以及实现Exendin-4结构稳定性的药剂学方法。在此基础上，选用生物降解聚合物乳酸-羟基（lactide-co-glycolide），PLGA］为成乙酸共聚物［Poly球材料，采用复乳法（W／O／W）制备Exendin-4微球，并对其理化性质进行评价。

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1.材料与方法

1.1主要试剂及仪器

Exendin-4（批号：20061120，纯度>95%）为杭

州九源基因工程有限公司产品；PLGA（LA／GA=50／50，固有黏度=0.17dL／g）为美国伯明翰聚合物公司产品；明胶（分析纯）和甘露醇（分析纯）均购自北京化学试剂公司；高速匀浆器（Ultra-TurraxT8）为德国IKA公司产品；圆二色光谱仪（JascoJ-810）为日本分光公司产品；HPLC分析仪（Waters1525BinaryHPLC

Pump，L-7420UVdetector）为美国Waters公司产品；C18柱（250mm×4.6mm）为天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品；扫描电镜（S-450）为日本日立公司产品；激光粒度测定仪（LS230）为美国贝克曼库尔特有限公司产品。

1.2Exendin-4的CD分析

在JascoJ-810圆二色光谱仪上进行，光源系统用氮气保护，样品采用10mm光径样品池，光谱扫描时均扣除溶液空白的干扰，在25℃下进行。测量参数为：波长扫描范围180～250nm，扫描速率100nm／min，

分辨率0.1nm，

响应时间1s，累积次数3次。利用圆二色光谱仪附带的杨氏法二级结构分析软件对实验数据进行各种二级结构含量的估算。

在不同pH值（2.0、4.0、7.4、9.0和12.0）条件下，测定Exendin-4（100μg／ml）的CD光谱，研究pH值对其二级结构的影响；在不同温度（25、40、60和80℃）、不同搅拌速度（5000、10000和15000r／min）、不同搅拌时间（1、2和5min）及加或不加冰浴条件下，测定Exendin-4（100μg／ml，pH7.4）的CD光谱，研究上述各种因素对Exendin-4结构稳定性的影响。

Exendin-4溶液（100μg／ml，pH7.4）1ml与二氯甲烷等量混合，冰浴条件下10000r／min匀浆搅拌2min后，3000r／min离心10min，取上清液，测定Exendin-4的CD光谱，研究油水界面对Exendin-4结构稳定性的影响。

选择甘露醇、乳糖、聚乙二醇（PEG）2000及明胶作为蛋白保护剂，分别配制成20mg／ml的溶液，取1ml含保护剂的Exendin-4溶液（pH7.4，100μg／ml）与二氯甲烷等量混合，冰浴条件下10000r／min匀浆搅拌2min后，3000r／min离心10min，取上清液，测定Exendin-4的CD光谱，研究保护剂对Ex－endin-4结构稳定性的影响。1.3Exendin-4微球的制备

采用复乳法制备Exendin-4微球。将1mgExendin-4溶解于1ml明胶水溶液（20mg／ml）中，形成内水

相；将50mgPLGA溶解于1mlCH2Cl2中，

形成油相，两者在冰浴条件下，于10000r／min匀浆搅拌2min得初乳，在磁力搅拌器搅拌条件（500r／min）下，将初乳倒入50ml2%聚乙烯醇（PVA）水溶液中，搅拌2min，得到复乳，将复乳倒进200ml5%NaCl水溶液中，在25℃条件下继续搅拌（100r／min）4h，挥发有机溶剂，固化微球，离心洗涤3次，冷冻干燥24h。

1.4Exendin-4微球的各项质量指标检测1.4.1形态、粒径大小及分布的测定：取Exendin-4微球冻干粉适量，置双面胶带上，涂布均匀。用EikoB-5离子镀膜仪溅金，S-450电子扫描显微镜观察微球的形状及表面形态。取微球混悬液2ml，加入适量蒸馏水稀释，调整透光度，采用LS230激光粒径测定仪测定粒径大小及分布。

1.4.2载药量及包封率的测定：精密称取5mg干燥微球，置于5ml离心管中，加入0.5mlCH2Cl2，涡漩2min；再加入蒸馏水4.5ml，涡漩2min；3000r／min离心10min，上清液过0.45μm微孔滤膜，滤液作

为供试品溶液，进行HPLC分析。色谱条件：

色谱柱Krosmail-C18（5μm，4.6mm×250mm），以乙腈／水／三氟乙酸（20／80／0.1）为流动相A，乙腈／水／三氟乙酸（80／20／0.1）为流动相B，采用梯度洗脱，柱温为常温，检测波长为215nm，进样体积为50μl。1.4.3CD分析：微球中Exendin-4的提取方法与HPLC测定微球载药量时相同，滤液作为供试品溶液作CD分析，并与Exendin-4标准品溶液的CD图谱进行比较。

1.4.4体外释药试验：精密称取含药微球5mg，置于5ml玻璃离心管中，以含0.02%Tween-80和0.02%叠氮钠的PBS缓冲液（pH7.4）作为释放介质，每管中加入1ml，置于恒温水浴摇床中，在100r／min，37℃条件下进行微球的体外释放度测定。分别在第1、4、7、14、21、28天取出3支离心管，3000r／min离心10min，弃去上清液，将残余微球加入0.5mlCH2Cl2，涡漩2min，再加入蒸馏水4.5ml，涡漩2min，3000r／min离心10min，上清液过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液，用HPLC法测定微球中剩余的Exendin-4含量，推算出已经释放的药量，并计算Exendin-4微球的累积释放百分率。以累积释放百分率为纵坐标，释放时间为横坐标，绘制Exendin-4的体外释放曲线。1.5统计学分析

实验数据以x±s表示，样本均数间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

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2.结果

2.1pH值、温度、搅拌速度、搅拌时间及冰浴对Exendin-4结构稳定性的影响

Exendin-4在pH7.4时，其CD光谱在208和222nm处出现双负峰，在192nm处有一个正峰，呈典型α-螺旋结构特征。在碱性条件下，208及222nm处的负峰强度稍有降低，但192nm处的正峰发生红移，在pH12.0时，红移至196nm，且峰强度随pH值的升高而减小；在酸性条件下，192、208及222nm处的峰强度均明显降低，并发生蓝移，见图1。不同pH值下Exendin-4的α-螺旋含量变化曲线显示，在中性条件下，Exendin-4的α-螺旋含量最高，而在酸性及碱性条件下则明显降低，分别由pH7.4时的58.7%±2.3%下降至pH2.0时的22.3%±1.2%和pH12.0时的18.4%±0.7%，且差异均有统计学意义（P=0.006～0.021），见图2。随着温度的升高，208和222nm处的负吸收峰强度逐渐减弱，当温度超过80℃时，减弱的趋势更加明显（P=0.012～0.033），见图3。

随着搅拌速度增加和搅拌时间延长，Exendin-4的α-螺旋含量显著降低（P=0.010～0.027）。但在冰浴条件下，搅拌速度的增加和搅拌时间的延长，对Exendin-4稳定性的影响并不显著（P=0.18～0.82），见表1。

8060l）opH7.4md40pH9.0／2mc20pH12.0,ge0pH4.0

］（d［θ-20pH2.0

-40

180190200210220230240250260270

波长（nm）

图1Exendin-4在不同pH值条件下的CD图谱Fig1.CDspectraofExendin-4atvariouspHvalues

2.2油水界面对Exendin-4结构稳定性的影响及保

护剂的作用

油水界面的引入对Exendin-4的稳定性具有严重的破坏作用，见图4。不同蛋白保护剂加入内水相后，不同程度地保护了Exendin-4的结构稳定性，其中以明胶的保护效果最佳，见图5。

6050）40旋（%螺30-α20100

2.0

4.0

7.4

9.0

10.0

12.0

pH

图2Exendin-4在不同pH值条件下α-螺旋含量的变化Fig2.α-HelixcontentofExendin-4atvariouspHval－

ues

80l）60o40m25℃

℃d40／2mc2080℃

,ge（d0［θ］-2060℃-40

180190200210220230240250260270

波长（nm）图3Exendin-4在不同温度条件下的CD图谱

Fig3.CDspectraofExendin-4atvarioustempera－tures

表1搅拌速度及搅拌时间对Exendin-4结构稳定性的影响Tab1.Effectsofhigh-speedhomogenizationonstabilityofsturctureofExendin-4

实验条件

实验次数

搅拌速度

搅拌时间

α-螺旋含量

（r／min）

（min）

冰浴（%）100+58.9±1.3200-58.7±2.23

50001-50.1±1.84100001-42.3±3.25150001-22.4±0.96

100002-26.3±1.17100002+55.3±1.68150002+52.7±1.59

15000

5

+

51.5±2.6

2.3Exendin-4微球的各项质量指标

2.3.1形态、粒径大小及分布：制备的Exendin-4微

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球为流动性良好的白色粉末，电镜下可见微球球形圆整，表面光滑，平均粒径为（25.3±3.2）μm，分布范围较窄，见图6。

80l）60o天然Exendin-4

md40／2m4

c20油水界面中抽提的Exendin-,ge（d0［θ］-20

-40

180190200210220230240250260270

波长（nm）

图4油水界面对Exendin-4结构稳定性的影响Fig4.EffectsofO／WinterfaceonstabilityofEx－endin-4

6050）旋（%40螺30-α2010

0

in-4剂醇糖00胶护露乳0保2甘明Exend品标准EG无P蛋白保护剂

图5不同蛋白保护剂对Exendin-4结构稳定性的作用Fig5.EffectsofproteinstabilizeronstabilityofEx－endin-4

2.3.2载药量及包封率：Exendin-4微球的载药量约为1.0%，药物包封率为72.3%±2.4%。2.3.3CD分析：Exendin-4标准品与Exendin-4微球的CD图谱基本重叠（图略），表明该方法制备微球对Exendin-4的二级结构没有造成破坏，稳定性良好。

2.3.4体外释药试验：Exendin-4微球第1天释放药物25.2%，第28天累计释放药物93.4%，分别以零级释放模型、一级释放模型、Higuchi释放模型、Weibull分布函数及Ritger-Peppas指数模型进行拟合，结果表明微球的释药曲线符合Higuchi释放模型，以扩散机制为主，具有良好的缓释效果。

a

141210布（%）8分6420

0.01

0.1

110

100

粒径（nm）

b

图6Exendin-4微球的扫描电镜照片（a）及粒径分布曲线（b）

Fig6.Scanningelectronmicrograph（a）andsizesdis－tribution（b）ofExendin-4microspheres

3.讨论

蛋白质及多肽的二级结构在CD光谱的远紫外

区（178～250nm）均有其对应的特征谱峰，蛋白质所表现出的CD光谱是其所含有的各种二级结构的光谱叠加，CD光谱已成为研究蛋白质二级结构非常有用的光谱技术，是简便及快捷地获得生物大分子

结构信息的手段之一［8，9］。因此，本文以CD光谱法

研究了在微球制备及释放过程中，pH值、温度、高速搅拌及油水界面对Exendin-4二级结构的影响以及冰浴、蛋白质保护剂等对Exendin-4结构稳定性的保护作用。结果表明，溶液酸碱性的改变、环境温度的升高、高速搅拌及由此产生的剪切力、油水界面的引入均会影响Exendin-4的二级结构，使其发生显著改变。蛋白质分子中α-螺旋和β-折叠的稳定性主要取决于分子内部的氢键，上述因素均会影响蛋白分子内部氢键的作用，进一步导致α-螺旋等二级结构的改变［10］。冰浴条件的引入，由于吸收了高速搅拌而产生的热量，明显降低了温度升高对Exendin-4结构造成的破坏作用，同时也表明温度的升高比搅拌剪切力本身对Exendin-4结构稳定性的影响更为明显。由于蛋白质及多肽具有表面活性而易于吸附在油水

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界面上，可能引起蛋白质多肽的伸展、变性及不可逆的聚集，使蛋白质的结构发生改变。蛋白质保护剂加入内水相后，不同程度地保护了Exendin-4的结构稳定性，其中以明胶的保护效果最佳。这些保护剂的作用机制各不相同，乳糖和甘露醇等糖类能使蛋白质保持天然、含水的致密结构；明胶加入后首先分布在有机溶剂和水相的界面，从而避免包囊蛋白质的变性和聚集，并且可消除PLGA降解过程中产生的酸性物质的不良影响，为包囊蛋白创造了pH值相对稳定的微环境；而PEG的加入则可使蛋白质的非共价聚集显著下降［6］。

经过条件优化制备的Exendin-4微球，保证了Exendin-4结构的稳定性，其他理化性质均符合规定。为了深入研究，需要进一步建立糖尿病动物模型，观察Exendin-4微球对糖尿病动物的治疗作用。

（致谢：感谢北京凯星医药科技开发中心的化薇同志对本文的校对！）参考文献

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（收稿日期：2009-03-20）

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