正常人肠道肠球菌esp基因与生物膜形成关系的初探

󰀁2010;41(5):827-830󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

JSichuanUniv(MedSciEdi)

正常人肠道肠球菌esp基因与生物膜形成关系的初探

戴锐睿,杨󰀁洋,熊鹿言,李晶洁,权泰鹏,余󰀁倩

四川大学华西公共卫生学院医学检验学教研室(成都610041)

󰀂

󰀁󰀁 摘要!󰀁目的󰀁了解正常人肠道肠球菌生物膜形成情况,探讨肠球菌esp基因与生物膜形成的关系。方法󰀁用PCR法检测肠球菌esp基因,用96孔聚苯乙烯板进行生物膜形成试验。结果󰀁84株正常人肠道肠球菌esp基因的检出率为14.3%,生物膜形成阳性率为25.0%,其中esp基因阳性株的生物膜形成率为83.3%,esp基因阴性株的生物膜形成率仅为15.3%。结论󰀁正常人肠道肠球菌形成生物膜的能力较弱,esp基因是肠球菌形成生物膜的重要因素,生物膜的形成不局限于esp阳性菌株。

关键词!󰀁肠球菌󰀁esp基因󰀁生物膜

中图分类号!󰀁R378

TheRelationshipBetweenespandtheAbilityofBiofilmFormationinEnterococcifromtheIntestinalTractofNormalPeople󰀁DAIRui󰀁rui,YANGYang,XIONGLu󰀁yan,LIJing󰀁jie,QUANTai󰀁peng,YUQian󰀂.󰀁DepartmentofMedicalTechnology,WestChinaSchoolofPublicHealth,SichuanUniversity,Chengdu610041,China󰀂Correspondingauthor,E󰀁mail:yuqian560@163.com

Abstract!󰀁Objective󰀁ToinvestigatethebiofilmformationofEnterococcifromtheintestinaltractofnormalpeople,tostudytherelationshipbetweenespandtheabilityofbiofilmformationinEnterococci.Methods󰀁PCRwasappliedtodetecttheespgenein84isolates.Andthebiofilmformationwasperformedin96wellpolystyreneplates.Results󰀁ThedetectionrateofespinEnterococciwas14.3%,therateofbiofilmformationwas25.0%,therateofbiofilmformationofesppositiveisolateswas83.3%,andthatofespnegativeisolateswas15.3%.Conclusion󰀁BiofilmformationisnotverycommoninEnterococcifromtheintestinaltractofnormalpeople,espisanimportantfactorofbiofilmformation,andtheabilityofbiofilmformationisnotlimitedtotheesppositiveisolates.

Keywords!󰀁󰀁Enterococci󰀁󰀁espgene󰀁󰀁Biofilm

󰀁󰀁肠球菌是人体肠道正常菌群之一,通常不引起发病,是一种重要的机会致病菌。由于近年来抗生素的滥用,使肠球菌的感染不断上升,成为主要的医院感染致病菌[1]。肠球菌普遍具有耐药性,使其感染的治疗非常困难,生物膜的形成是导致其耐药的重要原因之一

[2]

1.1.1󰀁菌株及其来源󰀁实验菌株:84株正常人肠道分离的肠球菌,由四川大学华西公共卫生学院医学检验学教研室保存。质控菌株:E.feacalis54菌株(生物膜阳性质控菌株),E.feacalis11262M菌株(生物膜阴性质控菌株),E.feacalis11262菌株(esp基因阳性质控菌株),均由西班牙Toledo󰀁Arana教授赠送。

1.1.2󰀁引物󰀁参照文献[4]设计esp基因的引物,上游引物5∀󰀁TTACCAAGATGGTTCTGTAGGCAC󰀁3∀,下游引物5∀󰀁CCAAGTATACTTAGCATCTTTTGG󰀁3∀,由金杰公司合成。

1.1.3󰀁主要试剂及仪器󰀁PCR反应试剂及Marker#购自BioFlux生物试剂公司,甲醇及无水乙醇购自成都市科龙化工试剂厂,THB培养基购自北京陆桥有限责任公司,96孔聚苯乙烯灭菌板购自CosmoBiosciencesInc。DNA提取试剂盒购自BioFlux生物试剂公司。酶标仪Model680(BIO󰀁RAD),Touching100B凝胶成像分析系统(天呈科技),580BR3729PCR反应仪(BIO󰀁RAD,USA),RC5C高速冷冻离心机(SorvallInstruments),TG16󰀁W微量高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)。。由esp基因编码的肠球菌表面蛋

白(Esp),是肠球菌表面的一种黏附素,与细菌的初始吸附有关[3],可能是生物膜形成的重要因素,但其与生物膜形成的关系还不甚明确。本研究以84株正常人肠道肠球菌为对象,通过对其生物膜与esp基因的检测,了解正常人肠道肠球菌形成生物膜的能力和esp基因的分布情况,并初步探讨肠球菌生物膜形成和esp基因的关系,为两者关系的深入研究及找到抑制生物膜形成的方法提供基本实验数据,同时通过观察生物膜形成的动态过程,为临床治疗肠球菌感染的给药时间提供参考。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁材料

󰀂通讯作者,E󰀁mail:yuqian560@163.com󰀁828󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁四川大学学报(医学版)2010年第41卷第5期󰀁1.2󰀁方法

1.2.1󰀁生物膜形成试验󰀁接种肠球菌于THB肉汤,37∃培养过夜,用0.5号麦氏比浊管,调整菌液浓度约为1.5%108CFU/mL。吸取200󰀁L上述菌液接种于THB肉汤,37∃培养过夜,用含0.25%葡萄糖的LB肉汤稀释菌液50倍,稀释液加入96孔聚苯乙烯板,200󰀁L/孔,5孔/株。37∃培养24h后,取出用PBS缓冲液洗板3次,晾干后用甲醇固定,1%结晶紫染色15min,水洗至无色,200󰀁L无水乙醇溶解结晶紫,读取630nm处吸光度(A)值,大于生物膜形成判断标准值即为生物膜形成试验阳性。用含0.25%葡萄糖的LB肉汤为空白对照,E.feacalis11262M为阴性对照,E.feacalis54为阳性对照。生物膜形成判断标准的确定:测定阴性对照吸25次,以󰀂x&3s为临界值,大于该值为生物膜形成阳性。

1.2.2󰀁肠球菌esp基因检测󰀁用DNA提取试剂盒提取肠球菌基因组DNA。PCR反应体系:10%ReactionBuffer(Mg2+free)2.5󰀁L,MgCl2(25mmol/L)2.0󰀁L,dNTPs(各2.5mmol/L)2.0󰀁L,上游引物(10nmol/mL)1.0󰀁L,下游引物(10nmol/mL)1.0󰀁L,Taq酶(5U/󰀁L)0.5󰀁L,模板DNA1.0󰀁L,灭菌超纯水15.0󰀁L,反应总体积25 0󰀁L。反应条件:94∃预变性5min;94∃变性1min,56∃退火1min,72∃延伸1min,35个循环;72∃终延伸10min。采用E.feacalis11262菌株作为阳性对照,超纯水作为阴性对照。扩增产物用10g/L琼脂糖凝胶,80V电泳30min后,在凝胶成像仪下观察结果,以Marker#作参照,判断扩增产物的大小。

1.2.3󰀁生物膜形成动态观察󰀁调整肠球菌浓度约为1.5%10CFU/mL,吸取200󰀁L于THB肉汤中,37∃培养过夜后,吸取500󰀁L肉汤培养物于装有盖玻片的培养皿中,再加入10mLTHB肉汤,37∃培养,分别于12h、24h、36h、48h取出盖玻片,用1%结晶紫染色1min,油镜下观察生物膜的形成情况。每个时间段均作平行样。

1.2.4󰀁统计学方法󰀁实验结果采用卡方检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

8

[5]

球菌中共有21株生物膜形成阳性,阳性率25 0%,说明正常人肠道肠球菌形成生物膜的能力较弱。2.2󰀁正常人肠道肠球菌esp基因检测结果

esp基因阳性的菌株在950bp出现明亮的电泳条带(图1)。84株正常人肠道肠球菌中有12株esp基因阳性,阳性率14.3%。

图1󰀁esp基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig1󰀁AgarosegelelectrophoresisofPCRamplificationofespM:Marker#;1:E.faecalis11262(positivecontrol);2:Negativecontrol;3󰀁10:IsolatesofEnterococcifromnormalpeople

2.3󰀁正常人肠道肠球菌esp基因与生物膜形成的关系

如附表所示:esp基因阳性株的生物膜形成率为83.3%(10/12),esp基因阴性株的生物膜形成率为15.3%(11/72)。经卡方检验,两组生物膜形成率差异有统计学意义(󰀂2=21.907,P<0.05),表明esp阳性株生物膜的形成能力比esp阴性株强。从表中还可知,生物膜的形成不仅局限于esp阳性菌株,esp阴性株的肠球菌也能形成生物膜。

附表󰀁esp基因与生物膜检测结果

Table󰀁TheresultsofdetectionofespandbiofilmformationespPositiveNegativeTotal

BiofilmformationPositive101121

Negative

26163

Total127284

2󰀁结果

2.1󰀁正常人肠道肠球菌生物膜检测结果

阴性对照A值为0.020&0.013,以A值大于0.059为生物膜形成试验阳性的判断标准,84株肠2.4󰀁正常人肠道肠球菌生物膜形成动态观察

肠球菌生物膜形成过程如图2所示,培养12h盖玻片上有少量细菌吸附,24h时细菌吸附增多,36h时细菌吸附达到顶峰,48h时细菌吸附明显减少。36h为本实验条件下生物膜形成的最佳时间。󰀁JSichuanUniv(MedSciEdi)Vol.41No.52010󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁829󰀁󰀁图2󰀁不同时间生物膜形成情况。%1000Fig2󰀁Biofilmformationatdifferenttimes.%1000

A:12h;B:24h;C:36h;D:48h

3󰀁讨论

从1970年以来,肠球菌导致的医院感染显著增多,已经成为医院感染的常见条件致病菌,通常引起尿道感染、腹腔感染、伤口感染以及生殖道感染,由于抗生素的广泛使用使其耐药性显著增强,给临床治疗带来极大困难。肠球菌对绝大多数抗生素具有天然或获得性耐药,而且是多重耐药性,其耐药机制复杂,生物膜的形成会增强肠球菌的耐药性。生物膜是细菌吸附在物体表面,由细菌及细菌分泌的胞外多聚基质构成的高度组织化的结构。生物膜的屏蔽作用可以阻碍或延迟细菌与抗生素的接触,生物膜内的细菌生长缓慢,对药物的敏感性降低,同时生物膜内的环境使细菌的表达与浮游菌不同,表面特征发生一些改变,提高了对抗生素的耐性[7]。

本实验结果显示正常人肠球菌生物膜的形成率较低,仅为25.0%,而有文献报道,临床患者尿、痰、血液、腹腔液和胆汁分离的肠球菌,其生物膜的形成率粪肠球菌为93.8%,屎肠球菌为91.8%[3],表明患者感染的肠球菌普遍具有形成生物膜的能力。造成这种差别的原因是感染部位的环境及条件更有利于生物膜的形成,还是能形成生物膜的肠球菌更易于在人体其它部位吸附、定植,有待进一步的探讨。

Toledo󰀁Arana等

[8]

[6]

物膜,与Kristich等的研究结果一致,esp基因阴性菌株形成生物膜的原因还有待进一步的研究。总的

来说Esp应该是影响生物膜形成的重要因素,它与细菌的初始吸附和定植有关,本实验结果显示esp基因阳性株生物膜的形成率明显高于esp阴性株,其差异具有统计学意义,与Tendolkar等的研究结果一致[10],但Esp并不是生物膜形成的唯一因素。有必要对影响生物膜形成的因素进行深入的研究。Wamel等的研究表明esp的表达在各菌株之间存在差异,且对环境的变化相当敏感。本实验12株esp阳性株中有2株没有形成生物膜,可能是在本次实验的条件下,esp基因没有表达,也可能缺少其它有利于生物膜形成的因素,有待进一步的研究。

在生物膜形成的动态观察中,通过结晶紫对细胞的染色观察细菌从吸附、聚集再到扩散的过程。结晶紫是对细胞染色,虽不能直接观察细菌胞外多聚基质的变化过程,但是生物膜内的细菌数与胞外多糖的分泌量存在时间一致性[12],所以细菌在盖玻片上的吸附、聚集再到扩散的过程可以反映生物膜从形成、成熟到扩散的过程。本实验36h时细菌吸附量最高,生物膜达到成熟阶段,随后生物膜开始扩散。有多种因素可以影响生物膜形成的时间如营养条件、温度、吸附材料等。营养条件好,生物膜可很快形成,同时成熟期的时间会很长,马立艳等[4]的研究显示生物膜从10h到24h一直维持在稳定的状态。生物膜一旦形成成熟,药物难以将其清除,所以应争取在生物膜形成的早期给药治疗。

参

1[11]

认为esp基因的表达与生物

膜的形成具有高度相关性,而且生物膜的形成能力仅局限于esp阳性菌株;Kristich等[9]的研究结果表明esp阴性菌株也能形成生物膜,其它因素,如GelE(明胶酶)的表达也能促进生物膜的形成,而且生物膜的形成对环境条件相当敏感,不一定需要Esp[9],本实验的结果显示esp阴性菌株也能形成生考文献

RosaRD,CretiR,BaldassarriL,etal.Relationshipbetween󰀁830󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁四川大学学报(医学版)2010年第41卷第5期󰀁biofilmformation,theenterococcalsurfaceprotein(Esp)andgelatinaseinclinicalisolatesofEnterococcusfaecalisandEnterococcusfaecium.FEMSMicrobiolLett,2006;256(1):145󰀁150.2

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(2010-03-03收稿,2010-05-13修回)

编辑󰀁于长谋

∋个案报告∋肾上腺泡性包虫病1例报告

蔡󰀁静,叶󰀁慧

1

2󰀂

1.四川大学华西医院血液内科(成都610041);2.四川大学华西医院感染性疾病中心(成都610041)

关键词!󰀁泡性包虫病󰀁肾上腺󰀁误诊 中图分类号!󰀁R535

󰀁󰀁患者,男,28岁,四川省甘孜州石渠县人,因(腰背及上肢疼痛半年,加重1+月)入院。入院前半年,患者无明显诱因出现腰背及上肢疼痛,无尿频、尿急、尿痛、排尿困难,无肉眼血尿、双下肢水肿等。入院前1+月,上述部位疼痛加重,未予任何处理,急诊收入院。既往有慢性乙型病毒性肝炎病史。查体无明显阳性体征。辅助检查:血常规提示,嗜酸性粒细胞5.2%(稍高),余指标无异常。腹部彩超提示,右肾上腺区混合性占位;右肾上腺区肿瘤?腹部血管彩超提示,右肾上腺肿瘤,下腔静脉局部受压;腹部CT提示,右肾上腺占位,有坏死出血,肝裸区可疑受侵;右肾上腺肿瘤合并出血?入院诊断:右肾上腺占位,右肾上腺肿瘤?择期于全麻下行右肾上腺肿瘤切除术。术中见右肾上腺区包块占位,大小约8cm%7cm%6cm,向上与肝脏紧密粘连,下内侧与下腔静脉壁粘连紧密,下方与肾脏粘连,包块周围散在肿大淋巴结数枚。术中取组织冰冻切片证实为炎症。包块极不规则,分离过程中出现包块破裂,溢出黄色脓液。病理大体标本:肉眼见(肾上腺)灰红不整形组织一块,大小2cm%1 5cm%0.8cm,其内查见结节2枚,直径0.5cm、1cm,切面灰褐,实性,质软。诊断为:右肾上腺包虫病(泡状棘球蚴),累及肝脏实质。予以口服阿苯达唑片400mgBid%12d。患

󰀂通讯作者,E󰀁mail:yehuidt@yahoo.com.cn

者出院后口服阿苯达唑乳剂20mLBid,目前于当地感染门

诊及疾控中心随访中。

讨论󰀁包虫病主要流行于畜牧地区,主要传染源为狗、狼、狐等。直接感染常是因牧民与狗密切接触,其皮毛上虫卵污染手指后经口感染。若狗粪中虫卵污染水源,人饮用后也可造成间接感染。该病主要累及肝脏(75%左右),其次在肺(10%~15%),其它部位如肾上腺、脾、胰腺等。

肾上腺包虫病多为囊肿,临床表现缺乏特异性。患者可有腰背部胀、痛,肾上腺激素分泌紊乱所致相应症状及囊肿压迫邻近器官所致相应症状,如压迫肝脏时可有右上腹胀痛,压迫胆道引起阻塞性黄疸等。该病在CT上表现为混杂密度肿块内多发的钙化灶或小囊泡征,其间可有液化坏死区。彩超上可表现为囊壁较厚、呈双层结构;囊内后壁前有随体位改变而移动的粒状强回声光点(包虫砂)。因影像学的表现易与其他性质的包块混淆,故易造成误诊。

多数肾上腺包虫病由肝脏病变区直接蔓延,或经淋巴或血行转移而来。原发于该部位的包虫病极其罕见。本例患者主要病变部位为右肾上腺,术前CT示肝裸区可疑受累,术后病理证实包虫病累及肝脏实质。近年研究证明肝裸区与右肾周间隙是相互通连的。因此,肝包虫病若位于肝右叶则有可能通过无腹膜覆盖的肝裸区,向下蔓延至右肾周间隙而侵犯右肾上腺。同样,原发病灶为右肾上腺这一罕见发病部位的泡性棘球蚴也可能借此(解剖通道)经肝裸区扩散至肝脏。

综上,对性质不明的占位性病变,应注意收集详细病史资料,包括流行病学史,结合临床表现及影像学资料综合考虑得出诊断。

(2009-12-22收稿,2010-03-05修回)

编辑󰀁沈󰀁进