海参糖胺聚糖抑制血管内皮细胞纤溶酶原活化抑制物—1的表达

中华皿液学杂志２００２年３月第２３卷第３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　ＴＴｅｕｍｌ￣ｄ　Ｍａｒｃｈ　２００２．ＶｏＬ　２３．Ｎ０　３　・研究报告・　海参糖胺聚糖抑制血管内皮细胞纤溶酶原活化　抑制物一１的表达　李志广王鸿利王学锋郭为民刘元时璩斌郭雪梅储海燕　海参糖胺聚糖（ｈｏｌｏｔｈａｒｉａ　ｇｂ，ｃｏｓａｒｒｒｉｎｏｇｌｃａｎ，ｈＧＡＧ）是从七　另外，将生长融台的细胞用１　０　ｔｑ／．ｄ的ＬＰＳ处理，并分５组　足海参体壁中提取的一种含岩藻糖的糖胺聚糖　它含有氯　基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖等　临床和动物研究表　明，ｈＧＡＧ具有抗凝、降低血粘度、降低血脂等作用　血管内皮细胞通过合成和分泌纤溶酶原激活物　组鲺型　纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）和尿激酶型纤溶酶原激活物ｃｕ—ＰＡ１　和纤溶酶原活化抑制物一Ｉ（ＰＡＩ一１）而参与诵节纤溶过程。　ＰＡｌ一１可以陕速地与ｔ－ＰＡ和ｕ—ＰＡ形成共价复合物，从而抑制　ｔ－ＰＡ和ｕ－ＰＡ：血浆ＰＡｌ一１水平增高与血栓形成倾向有关．　ＰＭ－Ｉ水平降低别与出血倾向有关　。　有研究表明ｈＧＡＧ能够抑制纤维蛋白单体聚合、提高纤　溶酶的活性、直接降解纤维蛋白原、抑制纤维蛋白躁的聚集　的功能，从而促进纤维蛋白凝块溶解　为了研究ｈＧ，￣Ｇ对纤　溶活性的作用及其作用机制．授们观察丁ｈＧＡＧ对受细菌脂　多糖（１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｅｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）刺激和未受ＬＰＳ刺激的人脐静　脉内皮细胞（ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｒＭｏｔｈｅｈａｌ　ｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）分　泌ＰＡＩ－Ｉ的影响。　材料和方法　１主要材料和试剂ｈＧＡＧ由江苏省常州华利康海洋牛物　有限公司提供：胶原酶Ｉ、肝素、ＬＰＳ为Ｓｉｇｍａ公司产品：Ｉ－ＰＡ　括性测定试剂盒、ＰＡＩ一１活性测定试剂盒、ｔ－ＰＡ　ＥＬＩＳＡ试剂盒　和ＰＡＩ－１　ＥＬＩＳＡ试剂盒均购自福建太阳生物技术公司；ＲＰＭＩ　１６４０、ＦＢＳ、ＴＲ］ｍｌ试剂和ＳｕｐｅｒＳｅｒｌｐｌ　ＩＩ？ｍｌｐｈｃａｔｌｏｎ试剂盒购自　Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ公司：　２细胞培养按Ｊａｌｆｅ等的方法　制备ＨＵＶＥＣ，用１　ｇｅＬ胶　原酶ｌ消化细胞，以３　ｘ　１０５的细胞密度将其接种于２４孔培　养板．经３～４　ｄ的培养，用例置显微镜观察接种的　皮细胞　生长至完全融合后用于实验。　将生长融合的细胞分为５组：０对照组：细胞不经任何　处理；②肝素组：向细胞培养液中加Ａ肝素，使其终浓度为　５．０ｔ￣ｍｌ；③１　０　，　ｈＧＡＧ组：向细胞培养液中加人ｈＧＡＧ，　使其终浓度为１．０ｔ￣／－￣；④５．０　ｒｒＬ【ｈＧＡＧ组：向细胞培养液　中加＾ｈＧＡＧ，使其终浓度为５　０　，ｍ１；⑤１０．０　，ｍｌ　ｈＧＡＧ　组：向细胞培养液中加凡ｈＧＡＧ　使其终浓度为１０　０　，　＝　上述各组均培养６　ｈ后收集培养上清和细胞。　作者单位：２０００２５上海第二医科大学附届瑞金医院、上海血液　学研究所［李志广（现在上海市血液中０＿９０００５１）、王鸿利王学锋　郭为民、刘元防、璃斌、郭雪梅、储海燕］　进行药物处理：①ＬＰＳ刺激组：向细胞培养液中加人ＬＰＳ．使　其终浓度为１　０　，ｍ１；②ＬＰＳ加肝紊组：向细胞培养液中加人　ＬＰＳ和肝素，使其终浓度分别为１．０　和５．０ｔ￣ｄｍｌ；③ＬＰＳ　加１　０　ｆ　ｒｔｄ　ｈＧＡＧ蛆：向细胞培养液中加＾ＬＰＳ和ｈＧＡＧ，使　其终浓度均为１　０　；④ＬＰＳ加５．０腭，　ｈＧＡＧ组：向细胞　培养液中加人ＬＰＳ和ｈＧＡＧ，使其终浓度分别为１　０　，　和　５　０　；⑤ＬＰＳ加１０．０　ｈＧＡＧ组：向细胞培养液中加　人Ｉ２Ｓ和ｈＧＡＧ，使其终浓度分别为１　０　ｖｇ／￣ｌ和１０．０　，　。　上述各组均培养６　ｈ后，收集培养上清和细胞：　３　ｔ－ＰＡ和ＰＡＩ一１活性测定采用发色底物法，用ｔ－ＰＡ和ＰＡＩ—　Ｉ活性测定试剂盒测定。按试剂盒说明书操作。　４　ｔ－ＰＡ和ＰＡｌ一１抗原测定用ＥＬ１ＳＡ试剂盒测定。按试剂　盒说明书操作　５　ＲＮＡ抽提和ＲＴ－ＰＣＲ检测ＰＭ．１　ｍＲＮＡ的转录应用　Ⅱ　ｌ试剂进行一步法抽提ＨＵＶＥＣ总ＲＮＡ，并利用Ｓｕｐｅｒ—　Ｓｃｒｉｐｔ　１１　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ试剂盒将２　ＲＮＡ加随机引物进行逆转　录。取１／８体积的逆转录产物进行ＰＣＲ扩增：ＰＡＩ－１引物　序列为：　上游引物：５＇－Ｇ？ｃＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＧＧ￣ＣＣ一３　（４０２—４２３），　下＿赫引物：５＇－ＡＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣ３ＷＩＶ，ＧＡＴＧＡＧＧ－３’（１　１５１—１　１７２）。　扩增产物的片段长度应为７７０　ｂ口　以Ｇ３ＰＤＨ基因作为内参　照，其上游引物为５＇－ＡｃｃＡｃ＾ｃ　ｃ　ｃＡＴ℃Ａｃ一３．下游引　物为５＇－Ｔｃｃ＾Ｏ巴　Ｃｃｃ１　Ｔｒ　唧＾．３　，扩增产物的片段长度　为４５２　ｂＤ。　ＰＣＲ扩增的条件为９４℃１　ｍｉｎ，５６℃１　ｍｉｎ，７２。ｃ　１　ｍｉｎ．　３５个循环．７２　延伸１０ｍｉｎ。取ｌ０　ＰＣＲ产物，用ＤＩ２０￣　作ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ公司产品），在１５　Ｌ琼脂搪凝胶上进　行电泳鉴定：　结　果　１　ｈＧＡＧ对ＨＵＶＥＣ分泌的ＰＡＩ一１和ｔ－ＰＡ活性的影响５．０　ｍ１和１０　０　ｍ１的ｈＧＡＧ可使ＰＡｌ一１活性下降；同样经５．０　ｍ１肝素处理的ＨＬＷＥＣ培养上清中的ＰＡ　Ｉ活性束发现明　显降低＝同时用试剂盒检测各组Ｉ－ＰＡ活性，经ｈＧＡＧ和肝素　处理后细胞培养上清中ｔ－ＰＡ活性均没有显著变化（表Ｉ）。　ＨＬＮＥＣ经Ｉｌｌｓ刺激后，其ＰＭ．１活性升高；经５．０　肝素和ＬＰＳ处理后，其ＰＡｌ－１活性较仅用ＬＰＳ刺激组有所降　低。同时检测各组ｔ－ＰＡ活性．经ＬＰＳ、ｈＧＡＧ和肝素处理后细　胞培养上清中ｔ－ＰＡ活性均没有显著变化（表１）：　维普资讯 http://www.cqvip.com

至　第２３卷　３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　“－¨ｔｌ０【Ｍ　曲２００２，　【２３　Ｎ０　３　５５　２　ｈＧＡＧ对ＨＵＶＥＣ分泌的Ｉ－ＰＡ和ＰＡｌ—Ｉ抗原的影唰１０　０　而易于被清除。我们研究发现　ｈＧＡＧ可降低体外培养的　，ｍ１的ｈＧＡＧ和肝素可使ＰＡｌ—Ｉ抗原下降。同时检测各组１一　ＰＡ抗原含量，经ｈＧＡＧ和肝素处理后细胞培养上清ｒ卜Ｉ—ＰＡ　抗原含量没有显著变化（表１）。　表Ｉ经ｈＧＡＧ和ＩＹＳ刺激后ＨＵＶＥＣ培养上清中ＰＡｌ－Ｉ　和【＿ＰＡ活性与抗原的检测结果（　）　组别ＰＡＬ】活性Ｐ＾　】抗原　。Ｐ＾活性　一Ｉ】Ａ抗原　（ＡＵ／ｍ１）ｔｖ，ｇ／ｍＩ　Ｊ　ｆＩＵ／Ｍ）（ｎｇ／ｎｄ１　注：各组样率数为２　ＨＬＮＥＣ经ＬＰＳ莉激后　其Ｐ＾１．Ｉ抗原含量升高；５　０峭，ｍ１　和１０．０　的ｈＧＡＧ可使经ＬＰＳ刺激升高了的ＰＡＩ—Ｉ抗原　含量有所降低；同样ＨＵＶＥＣ经５　０　肝素和Ｌ　处理后，　其ＰＡＩ—Ｉ抗原含量较仅用ＬＰＳ刺激组降低；同时用试剂盒检　测各组ｔ－ＰＡ抗原含量，经ＬＰＳ、ｈＧＡＧ和肝素处理后细胞培养　上清中ｔ－ＰＡ抗原含量均没有显著变化（表１）。　３　ｈＧＡＧ对ＰＭ—Ｉ　ｍＲＮＡ转录的影响在无Ｌ　存在的条件　下，ＨＵＶＥＣ基础ＰＡＩ－１　ｍＲＮＡ转录水平已很高，经ＬＰＳ刺激后　其ｍＲＮＡ转录水平有所增高；无论有无ＬＰＳ刺激，ｈＧＡＧ（１０　０　）和肝素（５　０　ｍ１）都能使ＰＡｌ・１　ｎａｑＮＡ有所下降（圄　Ｉ）＝　ｂｐ　７７０　１５２　１：ＬＰＳ＋肝素；２：ｈＧＡＧ（１０　０　，　）＋ＬＰＳ；３：ｈＧＡＧ（５．０　【Ｉｌ】）＋ＬＰＳ　４：ｈＧＡＧ（１　０　，　）＋Ｌ腭；５：Ｌ巧；６：肝素；７：ｈＧＡＧ（１０　０ｌ　ＴｒＩ【１　８：ｈＧＡＧ（５　０　，　）；９：ｈＧＡＧ（１　０　ｐｇｍＪ）；１０：对照；ｌＩ：分子量标志　图Ｉ　ｈＧＡＧ对ＨＵＶＥＣ　ＰＡｌ一１　ｍＲＮＡ转录影响的电泳结幂　讨　论　目前的研究结果认为，ｈＧＡＧ可能通过下列几种途径促　进纤维蛋白的溶解：①提高纤溶酶的活性；②直接降解纤维　蛋白原，使纤维蛋白凝胶中的纤维蛋白量减少而易于被纤溶　酶所清除；③抑制纤维蛋白原的聚集功能，影响单体聚集过　程，改变纤维蛋白凝胶结构，从而增强其对纤溶酶的敏感性　ＨＵＶＥＣ　ＰＡｌ－１的表达．如果ｈＧＡＧ在体内也能降低血管内皮　细胞Ｐ？ｄ一１的表述，则ｈＧＡＧ可　促进体内纤维蛋白溶解。　我们研究了经不同浓度ｈＧＡＧ处理后，ＨＵＶＥＣ的ＰＡｌ一１　活性、ＦＡＩ－１抗原以及ＰＭ－１【ｒＬ刚Ａ的变化。结果表明，５．０　，ｍｌ和１０　０　，ｍｌ的ｈＧＡＧ可以降低ＨＬＡ＇％Ｃ培养上清中的　ＰＡｌ－Ｉ活性，却不能抑翩ＰＭ－１抗原的分泌。在经ＬＰＳ刺激的　ＨＬＡ，＇ＥＣ实验组中，１０　０　ｈＧＡＧ可以降低ＰＡＩ－１的活性并　抑制ＰＡｌ—Ｉ抗原的分泌。用ＲＴ－ＰＣＲ方法，我们发现无论是否　经ＬＰＳ刺激，ＨＵＶＥＣ的ＰＡｌ－１　ｍＲＮＡ的表达都被ｈＧＡＧ抑翩。　找们未发现ｈＧＡＧ和肝素对［＿　的影响。Ｋｏｎｋｌｅ等　在　培养的ＨＵＴＥＣ上清中加人内皮细胞生长因子（ＥＣＧＦ）和肝　素，发现ＥＣＧＦ和（或）肝素可以降低血管内皮细胞ＰＡｌ－１　ｎ　ＲＮ＿壕选，而对ｔ－ＰＡ无影响。在此研究中，我们来发现　ｈＧＡＧ对ＨＬＡｒＥＣ培养上清中ｔ－ＰＡ括性和抗原有明显的作用，　而ｈＧＡＧ可以抑制ＰＭ－１的台成和分秘：所以．ｈＧＡＧ的净效　应应该为促进纤溶活性。　ＬＰＳ可　增强ＩｔＬ￣Ｔ￣中Ｐ？ｄ一１的表达，而对Ｅ．ＰＡ的表达　无明显作用。　我们发现，ｈＧＡＧ可以抑制血管内皮细胞合成和分秘　ＰＡ１．１，从而促进纤维蛋白溶解。ＩＧＡＧ使经ＬＰＳ刺激血管内　皮细胞表达增高的ＰＡＩ－１降低，达可能是ｈＧＡＧ阻止血栓形　成的另一机制：　参考文献　１樊绘曾．陈菊娣，林克忠刺参酸性粘多糖的分离及其理化性质　药学学报．１９８０，５｝２６３—２６９．　２樊绘曾．陈菊娣，吕培宏，等玉足海参酸性牯多糖的研究药学学　报，１９８３，１８：∞３．２０８　３张佩文　骆苏芳，钟春宁，等玉足海参酸性牯多糖的抗凝血作　用．中国药理和病毒学杂志，１９８８，２：９８一１０１　４王学锋，王鸿利，胡大萌，等．玉足海参酸性粘多糖（抗桂胶囊）抗　血桂形成作用的观察中华血液学杂志，１９９７，１８：４５７　５９　５　Ｗｉｎｕ￣Ｂ．ｐｌａｓｍｉｒｍ￣￣１￣ｔｉｖａｌｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＡＬＩ）ｉｎ　ｐｌａ￣：ｉｔｓ　ｍｌｅ　ｉｎ　ｔｈｍｍｂｏｔｌｃ　ｓｅａｓｅ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９５，７４：７Ｉ－７６＋　６　ＦａｙＷＰ，ＳｈａｐｉｏｒＡＤ，Ｓｌｉｆｈ正，ｅｔ　ａｌ　Ｃ￣￣ｅｔｅ　ｄｅｆｉｃｉ￣ｙ　ｏｆ　ｐｌａｓｗｉｎｏ—　ｇｅｎ—ａ　ｏｒ　ｉｎｌｉｆｂＪｔｏｒ　Ｄｙｅ　１　ｄｕｅ　ｔＯ　ａ　ｆｆｍｎｅｓｈｉｐｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｎ　Ｄ　Ｊ　Ｍｅｄ，　１９９２，３２７：１７２９—１７３３　７　Ｊ豳ＥＡ．Ｎ￣ｈｍａｎＲＬ，ＢｅｃｋｅｔＣＧ。ｄ　ａ１．Ｃｕｈｕ￣　ｄ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉ￣ｅｄ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ—Ｉｄｅｎｔｉｆｔｃａｆｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｒｉｔｅｒｉａ　Ｊ　ａｉｎ　Ｉｍ＇ｅｓｔ，１９７３，５２：￣４５－２７５６．　８　Ｍａｄｏｉｗａ　Ｓ，Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｎ．　一Ｊ，ｄ　ａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｎｆｉｎｏｇｍ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｌｉｆｂｉｔｏｔ－］ｅｓｓｃｅｉａｔｅｄ　ｔｈｔｒｍａ￣ｉｅｔｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｈａｔ［０￣ｔ　Ｂｌｏｏｄ，１９９９，９４：４７５４８２　９　Ｋ，ｍｋｌｅ　ＢＡ，ａｎｄ硼　Ｄ．Ｔｈｅ　ａｄｄＪｔｉｃ￣ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　０ｗ山ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｈｅＤ丑ｎⅡｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｔ＇ｅｉｎ　ｅＭｏｔｈｄｉａｌ　ｃｅｌｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅｎｓ　ｐｌｚｓ￣ｎ％－ｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ　ＣＡｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，１９８８，８２：　５７９－５８５　‘收稿日期：２００１—０５—２５）　（校对：王叶青）