人周期素依赖性激酶10真核表达质粒的构建及鉴定

中国生物制品学杂志２０１５年１月第２８卷第１期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｊａｎｕａｒｙ　２０１５，Ｖｏ１．２８　Ｎｏ．１　・４３・　・基础研究・　人周期素依赖性激酶１Ｏ真核表达质粒的　构建及鉴定　游颜杰ｔ，苑艺　，李文梅　，刘佳佳　，张晓辉　１．漯河医学高等专科学校药学系，河南漯河４６２０００；２．河南科技大学第一附属医院放疗科，河南洛阳４７１０００　摘要：目的构建人周期素依赖性激酶１０（ｃｙｃｌｉｎ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　１０，ＣＤＫ１０）真核表达质粒，并进行鉴定。方法采　用ＲＴ—ＰＣＲ法从人鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中扩增ＣＤＫ１０基因全长编码区序列，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中，　构建重组表达质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＤＫ１０，转染人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ．２，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测转染细胞中ＣＤＫ１０蛋　白的表达水平。结果重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＤＫ１０经双酶切及测序证实构建正确；经８００　ｇ／ｍｌ的Ｇ４１８　筛选２周后，获得过表达ＣＤＫ１０的稳定转染细胞系ＣＤＫ１０ｃ１和ＣＤＫ１０ｃ２；与空载体转染对照组相比，ＣＤＫ１０ｃ１和　ＣＤＫ１０ｃ２细胞中ＣＤＫ１０蛋白的表达量均显著升高（Ｐ均＜０．０５）。结论成功构建了人ＣＤＫＩＯ真核表达质粒。　关键词：人周期素依赖性激酶１０；真核细胞；基因表达；鼻咽癌　中图分类号：Ｑ５５６　Ｑ７８２文献标识码：Ａ文章编号：１００４—５５０３（２０１５）一０１—００４３—０３　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　１０　ＹＯＵ　Ｙａｎｄｉｅ　，ＹＵＡＮ　Ｙｉ，ＬＩ　Ｗｅｎ　ｍｅｉ，ＬＩＵ　Ｊｉａ－ｊｉａ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ．ｈｕｉ　）ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃ　，Ｌｕｏｈｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＣｏＵｅｇｅ，Ｌｕｏｈｅ　４６２０００，Ｈｅｎ鲫Ｐｒｏ　ｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈＯＦ：Ｙｏｕ　Ｙａｎ－ｊｉｅ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｏｕｙａｎｊｉｅ＠１６３．ｃｏｒｎ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉ￣ａ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｃｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　１０　（ＣＤＫＩＯ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣＤＫ１０　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＮＨＥ　１　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｃＤＮＡ３．１（十）．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｒｅｃｏｍ—　ｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ．ＣＤＫ１０　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ＣＮＥ　２　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＣＤＫ１０　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｂｏｔｈ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ—ＣＤＫＩＯ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ．Ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ＣＤＫ１０ｃ　ｌ　ａｎｄ　ＣＤＫ１０ｃ２　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｏｖｅｒ・ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤＫ１０　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　２　ｗｅｅｋｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｗｉｔｈ　８００　ｇ／ｍｌ　Ｇ４１８，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＣＤＫ１０　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒ（ｅａｃｈ　Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ＣＤＫ１０　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｙｃｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　１０（ＣＤＫ１０）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ；Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　细胞周期素依赖性激酶（ｃｙｃｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａ—　ＣＤＫ１０的进一步研究奠定基础。　１材料与方法　ｓｅｓ，ＣＤＫｓ）与细胞周期性蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）、细胞周期素　依赖性激酶抑制因子（ｃｙｃｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉ—　ｂｉｔｏｒ，ＣＫＩ）之间相互作用，构成真核细胞周期调控网　络的分子基础。ＣＤＫ１０是ＣＤＫｓ家族成员ｌ１］。前期　研究表明，ＣＤＫ１０在多种恶性肿瘤组织和肿瘤细胞　１．１细胞及质粒人鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１和ＣＮＥ２　及真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）均由漯河医学高等　专科学校分子生物学实验室保存。　１．２主要试剂ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清（ＦＢＳ）和　Ｇ４１８均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；限制性内切酶Ｋｐｎ　Ｉ　系中表达下调或缺失，推测其可能是新的候选抑癌　基因＿２　。本实验旨在构建ＣＤＫ１０真核表达质粒，　并转染人鼻咽癌ＣＮＥ２细胞，分析其表达效率，为　基金项目：河南省科技攻关—｝拽０项目（１４２１０２３１０４６４）；漯河医学高等专　科学校自然科学项目（２０１３，Ｙ—Ｊ　Ｙｏｕ）．　通讯作者：游颜杰，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｏｕｙａｎｊｉｅ＠１６３．ｃｏｎ　和ＢａｍＨ　Ｉ、Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、逆转录试剂盒、高保真　ＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ引物、ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００及感　受态大肠埃希菌ＤＨ５ｏ￣均购自日本ＴａＫａＲａ公司；