外源性VEGF促进大鼠Ⅱ度烫伤创面中晚期愈合

CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY

中国组织化学与细胞化学杂志

Vol.28.No.3June.2019

外源性VEGF促进大鼠II度烫伤创面中晚期愈合

靳丽丽，王瑞萍，孙梦，吾拉尔·阿德力，任雅璠，高彧，冯树梅

（新疆医科大学1临床学院，2基础医学院形态中心，乌鲁木齐 830011 ）

〔摘要〕目的 探究II度烫伤时外源性血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）对皮肤愈合及其对表皮干细胞（epidermal stem cells, ESCs）迁移、分化的影响 方法 健康Wistar大鼠随机分为VEGF组、空白对照组、阿西替尼（Axitinib, VEGF抑制剂）组。采用水浴烫伤法制备II度烫伤模型，分别以0.2μg/ml VEGF、PBS溶液和10μg/ml阿西替尼处理各组创面，各组均治疗7d，从烫伤至创面愈合分别在第2d、8d、14d及21d测量创面愈合情况，并取创面组织作组织学检测，运用免疫组化技术检测ECSs的分布及数量。 结果 ①创面愈合率：烫伤后21d VEGF组>对照组>阿西替尼组；②愈合速度：烫伤后1-7d空白对照组>阿西替尼组>VEGF组，其后 VEGF组愈合速度逐渐加快，第14d开始愈合速度表现为VEGF组>空白对照组>阿西替尼组；③组织学变化：烫伤后8-21d，VEGF组表皮细胞增殖明显，表皮修复和毛囊再生迅速，均早于空白对照组及阿西替尼组。④ECSs阳性细胞率变化：烫伤后第8-14dVEGF组ECSs阳性细胞率明显高于空白对照组和阿西替尼。结论 II度烫伤时，外源性VEGF在愈合中晚期加快愈合速度使愈合时间明显缩短，并且促进毛囊汗腺的再生使修复后的创面在外观、功能与正常皮肤相近，有助于提高全层皮肤创面的愈合质量

〔关键词〕血管内皮生长因子 ；II度烫伤； 皮肤愈合 ；表皮干细胞

〔中图分类号〕R644 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2019. 03. 005

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Exogenous VEGF promotes the mid-late period wound healing of II degree scald in rats

Jin Lili1, Wang Ruiping1, Sun Meng1, Wulaer1, Ren Yafan1, Gao Yu1, Feng Shumei2*

(1 School of Clinical Medicine, 2 Department of Morphology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, Urumqi

830011,China)

〔Abstract〕Objective To investigate effect of exogenous vascular endothelial growth factor (VEGF) on the healing of degree II scald as well as migration and differentiation of epidermal stem cells (ESCs). Methods Healthy Wistar rats were randomly divided into vascular endothelial growth factor (VEGF) group, blank control group and Axitinib group (inhibitor of vascular endothelial growth factor). The degree II scald model was prepared by water bath scalding method. The wounds in each group were treated with 0.2 μg/ml VEGF, PBS solution and 10μg/ml Axitinib for 7 days, respectively. The area of scalded wound was measured at 2d, 8d, 14d and 21d from scalding to wound healing, and the wound tissue was taken for histological examination to detect the distribution and quantity of epidermis stem cells by immuno-histochemical technique. Results ①Wound healing rate: VEGF group > control group > Axitinib group, 21 days after scald. ②Healing speed: From 1st to 7th day after scalding, control group > Axitinib group > VEGF group. After-wards, the healing rate of the VEGF group was gradually accelerated, and from 14th day on, the rate of healing was as follows: VEGF group > blank control group > Axitinib group. ③Histological change: From 8th to 21st day after scalding, the proliferation of epider-mal cells as well as the epidermis repair and hair follicle regeneration were rapid in VEGF group, and both were earlier than those in blank control group and Axitinib group. ④Changes of ECSs positive cell rate: From 8th to 14th day after scalding, the positive cell rate of ECSs in VEGF group was significantly higher than that in blank control group and Axitinib group. Conclusion During the healing of II degree scald, exogenous VEGF accelerates the healing in the mid-late period, thereby shortens the healing time and promotes the regeneration of hair follicle sweat glands, and thus makes the repaired wounds similar to normal skin in appearance and function, which helps to improve the healing quality of full-thickness skin wounds.

〔Keywords〕Vascular endothelial growth factor; II degree scald; skin healing; epidermal stem cells

〔收稿日期〕2018-12-03 〔修回日期〕2019-06-10

〔基金项目〕国家自然科学基金（81660324）；新疆医科大学大学生创新实验项目（CX2017099）〔作者简介〕靳丽丽，女（1997年），汉族，本科

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：fengshm@sina.com

222中国组织化学与细胞化学杂志

第28卷

烧伤是物理、化学、放射等诸多因素作用于机体所造成的一种极其复杂的外伤性疾病[1,2]。据统计，中国烧伤年发病率约为1.5%～2%，即每年约有2000万人遭受不同程度烧伤。大面积深度烧伤患者的治疗，要求创伤后创面快速愈合，修复后创面不但外观、厚度或皮肤高度接近正常，同时其微细结构也要接近正常皮肤，甚至含有各种皮肤附件（汗腺、毛囊、皮脂腺等）。由此，加速创面愈合与促进受伤皮肤修复后功能的重建已成为组织修复领域需要解决的重大问题[3]。

创面愈合是一个复杂而又高度协调的过程，包括炎性反应、组织细胞增殖和组织重建3个互相重叠但又具有不同特点的阶段[4]。大量研究证实，在体液渗出、创面愈合、瘢痕形成等过程中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）均有参与[5]。血管损伤后6~12h血浆VEGF达高峰，48~72h逐渐下降，与烧伤休克期体液渗出病理生理过程一致[6]。 通过烧伤病人与健康者血清VEGF浓度对比研究后发现，烧伤后血浆VEGF水平迅速增高直至烧伤愈合后下降，同时局部组织肿胀，从而推测VEGF对严重烧伤病人体液渗出肿胀有特定作用[7] ，并且血管内皮生长因子可促进淋巴管内皮细胞[8-10]，骨髓间充质干细胞的增殖、分化[11]。此外，表皮干细胞（epidermal stem cells, ESCs）在皮肤伤口愈合及皮肤新陈代谢更新过程中起着至关重要的作用[12] 。ESCs脱黏附离巢后才具有迁移能力，并最终通过再上皮化修复创面，故ESCs脱黏附离巢是启动包括烧伤创面在内的皮肤创面自行愈合的关键步骤[13]。

为明确外源性VEGF对烧伤愈合的作用，本实验拟建立大鼠II度烫伤模型，分别局部使用外源性VEGF及其抑制剂，观察不同时期创伤愈合过程的差异，以B1整合素阳性细胞显示表皮干细胞趋化、定向迁移的差异，为临床治疗热损伤皮肤缺损提供依据。

材料与方法

1 实验动物

40天健康Wistar大鼠48只（新疆医科大学动物实验中心提供，动物许可证：SCXK（新）2016-0003），雌雄不限，体重180g~200g。2 主要试剂

VEGF（德国PEPROTECH），阿西替尼（辉

瑞医药保健有限公司），Phospho-ITGB1（Thr788） polyclonal antibody （E-AB-20904）武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（兔来源），兔二步法二抗试剂盒（PV-6002）、DAB染色试剂盒（ZLI-9018）由北京中衫金桥公司提供 。

3 动物模型制备

[3]

Wistar大鼠48只，随机分为VEGF组、空白对照组和阿西替尼（VEGF抑制剂）组。所有实验鼠均正常饲养，烫伤前1d用电动剃毛机推去背部脊柱两侧毛，10％硫化钠溶液脱毛[14]，脱毛面积约5×10cm 2 ，使用2％戊巴比妥纳（40mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后将动物背部朝上固定，将水浴预热到100℃的50g砝码（直径为2.0cm）稍加压力压于大鼠背部脊柱上下脱毛区，持续15s，形成皮肤II度烫伤模型（病理切片证实），每只大鼠共2个烫伤创面。烫伤后空白对照组背部涂抹红霉素软膏预防感染，自由饲养。VEGF组伤后立即在每个伤口两边取对称两点由边缘向中央经皮下注射0.2µg/ml VEGF溶液（0.02ml/cm2）；阿西替尼组由边缘向中央经皮下注射10µg/ml阿西替尼溶液（1ml/kg）；空白对照组不做处理，各组注射完毕后均在烫伤部位涂抹红霉素软膏。每只大鼠分笼饲养，每日给药1次并用红霉素软膏涂抹，连续7d。饲养期间动物自

由进食、水。4 观测指标及方法

创面肉眼观察：每日观察创面情况，如创面水肿渗出程度、是否干燥、有无分泌物、创周红肿变化等。

创面面积计算及创面愈合程度：自烫伤后第1d用直角尺测量烫伤创面面积 并记录计算愈合率，每日一次，直到第21d。创面愈合率（％）＝（开始烫伤面积－未愈合创面面积）/开始烫伤面积[14] 。计算烫伤后2d、4d、8d，14d 及 21d的创面愈合程度。创面愈合速率=（第n天的烫伤面积-第n+m天未愈合创面面积）/m（n和m为非零自然数）。

创面组织病理学检查：分别于烫伤后第2d、第4d、第8d、第14d和第21d每组随机断颈处死3只鼠，各组动物分别处死后每个创面切取一半的皮肤组织，用4℃生理盐水漂洗，洗净创面组织淤血，铺平装在包埋盒以10%中性福尔马林缓冲液固定，常温保存，作组织石蜡切片，采用苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察表皮层和真皮层的变化，判断烫伤深度及愈合过程中炎性细胞变化情况；皮肤组织

第3期靳丽丽等.外源性VEGF促进大鼠II度烫伤创面中晚期愈合 223

石蜡切片作SP二步法免疫组织化学染，观察B1整合素免疫反应性5 统计学分析方法

用SPSS 22.0软件对数据进行统计处理，所有数据均以均数±标准差表示，多组间进行比较及方差分析，P<0.05有统计学意义。

结 果

1 VEGF促进创面愈合

肉眼观察（图1）：伤后2d大鼠烫伤皮肤坏死

渐渐变黑，失水干燥、发硬，表面凹凸不平，坏死皮肤边缘翘起周围皮肤收缩，界限清晰。伤后5~7d，痂皮形成，表面棕黄色，烫伤区域缩小。同时伤口周围正常皮肤收缩，使伤口总面积逐渐缩小。VEGF组、空白对照组、阿西替尼组动物的伤口表现基本类似；伤后21d各组伤口愈合差异显著，VEGF组伤口已基本上皮化，但有部分大鼠伤口也有硬痂且不易剥脱。空白对照组伤口中部大片硬痂覆盖，阿西替尼组表现与空白对照组相同但仍有部分创面为开放性伤口，可见淡黄色分泌物和组织红肿。

图1 VEGF对烫伤创面残留面积的影响。箭头所示残留面积

Fig.1 Effect of VEGF on residual area of scalded wound. Arrow: the residual area of scalded wound

病理组织学观察（图2）：烫伤后第2d 三组均皮肤附属器坏死，创面有大量炎性细胞浸润、浆液和纤维素渗出，成纤维细胞数量增加；第8d，VEGF

组可见表面有坏死的表皮组织，表皮细胞增殖移行血管；空白对照组的烫伤部位累及真皮乳头层，表面有坏死的表皮组织，可见少量表皮细胞增殖（主

可见损伤累及真皮及部分网织层，毛囊、皮脂腺等（主要为棘层细胞），大量肉芽组织，大量新生毛细

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第28卷

要为棘层细胞），部分新生毛细血管，偶有肉芽组织；阿西替尼组烫伤部位累及真皮乳头层，表面有坏死的表皮组织，大量新生的毛囊和皮脂腺由真皮网状层迁移至乳头层；第14d，VEGF组可见表皮增厚明显，间质增多，毛囊增多，表皮细胞增殖旺盛，大量肉芽组织增殖达到高峰，大量新生毛细血管；

第21d，VEGF组烫伤部位基本修复，表皮层结构基本完整，偶有肉芽组织，大量胶原纤维形成；空白对照组表皮层增殖，少部分未愈合，可见部分炎细胞浸润，有较多肉芽组织；阿西替尼组创面未完全愈合，新生毛细血管生成，毛囊和皮脂腺少见，大量炎细胞浸润。

图2 VEGF对烫伤创面组织病理学影响的HE染色观察。比例尺，10μm

Fig. 2 Observation by HE stain for effect of VEGF on histopathology of scalded wounds. Scale bar, 10μm

2 VEGF在中晚期使II度烫伤的创面愈合速度加快和愈合率提升

VEGF组烫伤后1~8d愈合速度虽然最慢，但整体愈合速度呈上升趋势，随着愈合时间延长，到伤后第8d，VEGF 组愈合速度逐渐加快，第15d愈合速度达到最快超过其余两组且继续加快，烫伤后21d伤口几乎完全愈合，仅留一细线状伤疤。在空白对照组，1~7d愈合速度最快，于第4d愈合速度达到峰

值，随后迅速下降，且于第7~21d愈合速度趋于稳定但仍有轻微减慢趋势，伤后第21d伤口仍有大块伤疤覆盖。阿西替尼组愈合速度变化趋势与空白组相似，但均低于空白组，且伤后第21d伤口仍为开放性伤口，可见黄色分泌物（图3）。

VEGF组创面愈合速度在中晚期最快且呈递增趋势，其余两组在中晚期愈合速度减慢。烫伤后21d VEGF组创面的平均愈合率为85.31%。而空白对照

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组创面愈合率为77.52%，阿西替尼组创面愈合率为65.82%，结果有统计学差异。提示VEGF能有效促

进大鼠皮肤II烫伤后伤口的愈合（图4）。

图3 VEGF对烫伤创面愈合速度的影响

Fig. 3 Effect of VEGF on scalded wound healing speed

图4 VEGF对烫伤创面愈合率的影响

Fig. 4 Effect of VEGF on scalded wound healing rate

3 VEGF加速烫伤创面的β1整合素表达

免疫组织化学染色显示，三组皆于伤后2d发现β1整合素阳性细胞。VEGF组β1整合素阳性细胞率比空白对照组和阿西替尼组阳性细胞率更早，于第8d达到峰值，峰值显著高于其他两组，之后迅速下降但总体保持较高水平。空白对照组阳性细胞率达峰时间（第14d）早于阿西替尼组，但峰值低于VEGF组，之后持续下降。阿西替尼组阳性细胞率达峰时间最晚（第21d），水平一直较低（图5，图6）。

讨 论

本实验采用砝码水浴法建立大鼠深Ⅱ度烫伤模型，以VEGF及其抑制剂阿西替尼干预啮齿动物热损伤模型，研究皮肤愈合过程的动态性变化特点及

表皮干细胞的迁移情况。我们研究发现，造模后21d VEGF组创面的平均愈合率最高，空白对照组创面次之，阿西替尼组创面愈合率为最低。阿西替尼作为VEGF抑制剂，可以抑制受体酪氨酸激酶VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的活性从而阻止VEGF与受体结合[15]，阿西替尼组自第8d后愈合速度，愈合率均低于空白对照组和VEGF组，表明在烫伤中晚期阿西替尼抑制VEGF，进而影响皮肤愈合进程。我们的实验表明，在皮肤修复中晚期，VEGF能有效促进大鼠皮肤II烫伤后伤口的愈合。此外，VEGF组毛发茂密生长，表明VEGF不仅促进血管生成，还具有调控毛囊周期性循环和促进毛发生长的作用，可在恢复皮肤完整结构和功能的研究和治疗中发挥关键性作用[16]。

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第28卷

图5 免疫组织化学染色显示第8d VEGF组β1整合素阳性细胞增加。A，VEGF组；B，阿西替尼组创；C，空白对照组；比例尺，

10μm

Fig. 5 Immunohistochemical staining showed that β1 integrin positive cells increased in VEGF group on the 8th day. A, VEGF group; B, axitinib group; C, blank control group; scale bar, 10μm

图6 VEGF对烫伤创面β1整合素阳性细胞率的影响。与对照组比较：*，0.01Fig. 6 Effect of VEGF on integrin β1 positive cell rate in the scalded wound. Compared with the control group: *, 0.01

VEGF组在烫伤与此同时我们也在实验中发现，

早期（1~8d）愈合速度显著低于其余两组。而既往研究结果表明，VEGF mRNA在正常皮肤内表达水平低，烫伤后创面组织中表达明显增加；伤后1d即迅速升至峰值，伤后3～14d表达逐渐下降，烫伤后6～12h血浆VEGF即达高峰[5]；早期机体由于烫伤造成创面缺血缺氧，通过低氧诱导因子（HIF-1）介导，与VEGF 5’端增强因子作用，迅速诱导VEGF mRNA的表达[17]， 导致早期内源性VEGF大量释放。本实验中早期VEGF组愈合速率低可能由于负反馈机制所致，烫伤早期内源性VEGF大量释放，外源性VEGF的同步干预启动体内负反馈抑制作用，从而抑制VEGF发挥作用，愈合中晚期血浆内源性VEGF逐渐减少，抑制作用解除，二者共同发挥促进创面愈合作用。

皮肤结构的完全恢复，不仅表现在皮肤缺损修

复，皮肤厚度恢复，还体现在皮肤附属器结构的恢复和重建，本实验中VEGF组毛发生长浓密，显微镜下亦可见大量毛囊结构，揭示VEGF还可促进毛囊的生成。实验证实，皮肤损伤后，随炎性细胞的趋化、渗出，VEGF在表皮及毛囊上皮细胞的表达逐渐减弱，而在中性粒细胞、巨噬细胞及成纤维细胞的表达逐渐增加[18]。 本实验中应用外源性VEGF可以弥补内源性VEGF在表皮及毛囊表达减弱的缺点，从而促进实验组表皮及毛囊再生修复，达到促进创面功能性愈合的目的。

烧伤后，ESCs脱黏附离巢、迁移、再上皮化是创面修复的重要物质基础[13]本实验研究发现平均β1整合素阳性细胞率：VEGF组＞空白组＞阿西替尼组，表明VEGF具有促进表皮干细胞迁移分化的作用；而阿西替尼组达峰时间最晚且水平一直很低，可能是由于其抑制内源性VEGF与相应受体结合达

第3期靳丽丽等.外源性VEGF促进大鼠II度烫伤创面中晚期愈合 227

到抑制延迟表皮干细胞的迁移分化的效果。此外我们发现VEGF组达峰明显提前于阿西替尼组和空白对照组，即VEGF组ESCs迁移速度最快，并且最早达到表皮全层分布，表明VEGF能够加速基底层残留的ESCs向创缘中心增殖迁移分化，缩短实现再上皮化的时间，更快地促进创面愈合并且与HE染色结果相吻合。

皮肤愈合的机制颇为复杂，研究人员运用不同实验动物（大鼠、小鼠、兔、豚鼠）、多种造模方法（皮肤线性损伤、热损伤、机械皮肤切除创伤）试图阐明影响创伤愈合的关键因子和机制。研究中发现，不同种属动物由于皮肤结构差异，创伤愈合过程细胞因子表达特点有所不同，皮肤修复机制也有所不同。如啮齿动物的研究表明，在创伤修复中皮肤收缩力首先发挥作用，其次才是再上皮化

[19,20]

，提示

各种类型的动物模型，不能完全复制和模拟人体皮肤创伤过程。本研究运用啮齿动物大鼠，以砝码水浴建立深Ⅱ度烫伤模型，通过VEGF及其抑制剂，证实VEGF在愈合中后期加快创面愈合速度，缩短了病程，并且促进毛囊汗腺的再生使修复后的创面在外观、功能与正常皮肤相近，但本研究结果对于人体临床热损伤修复的应用仍需进一步研究证实。

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