扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的分离和cDNA序列分析

2022-07-19 来源：年旅网

第28卷　第1期2010年2月

石河子大学学报(自然科学版)

JournalofShiheziUniversity(NaturalScience)

Vol.28　No.1Feb.2010

文章编号:100727383(2010)0120037206

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的分离和cDNA序列分析

赵文娟1,2,朱建军1,2,吕廷德1,2,薄新文2,王新华2

(1石河子大学动物科技学院,石河子832000;2新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832000)

摘要:为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物提供基础。通过构建的扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质结构的初步预测。结果显示:获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因DAZ基因,cDNA全长1905bp,包含1个完整的ORF,编码562个氨基酸,登录号为:GH291478。蛋白理论分子量为61.3169kD,等电点为4.77,不稳定系数

50.27,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472。二级结构预测该蛋白有1个跨膜区域,以无规卷曲(L)为主,没有

二硫键结合位点。本研究成功分离扩展莫尼茨绦虫DAZ基因。关键词:扩展莫尼茨绦虫;DAZ基因;序列分析中图分类号:S858　　　　文献标识码:A　　　　

TheIsolationandSequenceAnalysisofthecDNAEncoding

MonieziaexpansaDeletedinAzoospermia

ZHAOWenjuan1,2,ZHUJianjun1,2,LΒTingde1,2,BOXinwen2,WANGXinhua2

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China;2KeyLaboratoryofSheepBreeding&BiotechnologyofXPCC,Shihezi832000,China)

Abstract:Toprovideafoundationforfurtherresearchevenasmodelorganisms,cloneswereselectedran2domlyfromthecDNAlibraryandsequencedbyusingthemethodofexpressionsequencetags(ESTs).No2velgeneswereacquiredbyprimer2walking.Byusingbioinformatics,thecDNAsequenceencodingM.ex2pansadeletedinazoospermia(DAZ)wasanalyzed,includingsearchingtheORF,translatingthenucleotidetoproteinsequence,searchingsimilarityandpredictingofinitialproteinstructure.TheresultsshowedthatannewgeneofM.expansa-DAZgeneobtained:thefull2lengthofcDNAwas1905bp,acompleteORFen2coding562aminoacids,accessionnumberwasGH291478.TheacademicpIwas4.77andmolecularweightwas61.3169kDa,instabilityindex:50.27,aliphaticindex:65.04,grandaverageofhydropathicity:-0.472.Theconclusionisthat:DAZgenewassuccessfullyseparatedfromM.expansa.Keywords:M.expansa;deletedinazoospermia;sequenceanalysis

　　莫尼茨绦虫、细粒棘球绦虫和日本血吸虫同属于扁形动物门,并且在新疆地区分布广泛,有良好的材料来源。因此,利用莫尼茨绦虫来研究对人类危害更大的人畜共患的寄生虫病,可以有效的减少实

收稿日期:2009204219　

验过程中对实验人员的危害。莫尼茨绦虫有发达的生殖系统,每一成熟的节片内有两套成熟的生殖系

统[1],以莫尼茨绦虫为模式生物来研究其他生物甚至人类生殖疾病的发生与治疗,成为当前科研工作

基金项目:国家重点基础研究发展计划前期研究专项(2006CB708512)

作者简介:赵文娟(19832),女,硕士生,专业方向为分子寄生虫学;e2mail:zwj2130@163.com。

通讯作者:薄新文(19692),男,研究员,从事寄生虫分子生物学研究;e2mail:boxinwen@yahoo.com.cn。

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者的重要研究课题。

无精症缺失基因(deletedinazoospermiagene,DAZ)定位于Y染色体长臂无精症因子c区(azoo2spermiafactorc,AZFc),在大多数个体中有4种拷贝,分别被命名为DAZ1、DAZ2、DAZ3和DAZ4[2]。有研究表明,DAZ基因在睾丸组织中特异表达,其产物为RNA结合蛋白,可能在生精过程中发挥着重要作用[3]。DAZ基因的全部拷贝缺失已被普遍认为是生精障碍的重要遗传病因。近年来,有文献报道,DAZ部分拷贝缺失的某些类型也与人类的生精障碍有关[4,5]。

本文从扩展莫尼茨绦虫克隆得到DAZ基因,通过序列分析了解此基因在绦虫的理化性质,寻找保守序列,以期为利用其作为模式基因研究其他物种的相关疾病奠定分子基础。

板,37℃培养过夜。1.2.2　阳性克隆的分离及测序

挑取单个白色菌落,用X2gal再次筛选后并扩增,用天根质粒DNA纯化试剂盒提取质粒。于ABI377型自动测序仪上进行DNA序列测定(由上海生工有限公司协助完成)。1.2.3　新基因的获取与序列分析

将上述原始测序结果进行拼接后,在线进行Blast分析,得到扩展莫尼茨绦虫新的EST并登录GenBank。根据EST分析结果分配克隆重叠群,分

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　扩展莫尼茨绦虫cDNA文库

析与拼接克隆重叠群,对拼接后的序列用Primer

5.0软件设计步移法测序引物。

用上述测序引物进行测序直至出现PolyA,将原始测序结果进行编辑后获得新基因的全长cDNA序列。通过NCBI网站(http://www.ncbinih.nlm.gov/blastX)与其他物种的同源蛋白序列进行比对分析,利用DNAMAN进行多序列联配和种系进化树分析;利用开放阅读框探寻器(ORFfinder)确定其完整编码序列并显示其编码的氨基酸序列。用蛋白分析专家系统服务器ExPASyPro2teomicsServer(http://ca.expasy.org/)所提供的蛋白质在线分析工具,如protparam(http://au.ex2pasy.org/tools/protparam.html)预测氨基酸序列的相对分子质量、等电点、稳定性指数等理化性质,InterProScan(http://www.ebi.ae.uk/Inter2ProSean/)和MotifScan(http://myhits.isb2sbi.ch/cgi2bin/motif_scan)预测氨基酸序列中的基序(mo2tif)和功能域;用PredictProtein(http://cubic.bloc.columbia.edu/predictprotein/)预测氨基酸序

由新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室构建。该文库采用smartcDNA技术构建,以冻干质粒形式保存。其包装效率为1.01×106pfu/mL,插入片段平均长度为1.39kb左右,重组率在94.7%以上。1.1.2　载体及宿主菌

载体:pBluescriptIISK3,可用于DNA的表

α。达;宿主菌:大肠埃希菌DH51.1.3　引物

测通全长用通用引物M13和特定引物5′2

CCAACGTTATGATCTGCACC23′。所有引物均由上海生工有限公司合成

列的跨膜区和拓扑结构以及二级结构、用SWISS2MODEL(http://swiss2model.expasy.org/)进行二级结构基础上的三级结构同源建模,预测蛋白质的空间构象。

1.2　方法

1.2.1　cDNA文库的转化及筛选

α接种于LB培养基中,37℃,将大肠杆菌DH5

220r/min振摇培养2h后,用CaCl2制备感受态细

μ胞。加入2L原文库,混匀,冰浴30min,42℃热休

μL,37℃克90s,立即冰浴2min,加LB培养基800

120r/min振摇1h,13000r/min离心30s,去上清。

2　结果与分析

2.1　DAZ基因的cDNA序列

该基因cDNA全长1905bp,包含1个完整的ORF,从142bp到1830bp的位置,编码562个氨基

μg/mL氨苄青霉素、将沉淀涂布于含100200mg/L

IPTG、20mg/LX2gal的固体LB琼脂培养基中铺

酸,终止密码子TAA出现于1827bp处,3′端含有

polyA尾(图1)属于RRM超家族。

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图1　DAZ基因的cDNA序列

Fig.1cDNAsequenceofDAZgene

2.2　蛋白序列比对

将扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的蛋白序列和NC2BI数据库里的蛋白进行比对,选取日本血吸虫(Schis2

tosomajaponicum),日本三角涡虫(Dugesiajaponica)、

2.3　蛋白理化特性

扩展莫尼茨绦虫该蛋白理论分子量为61.3169kD,等电点为4.77,不稳定系数50.27,大于阈值40则性质不稳定,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472(图3),蛋白总体疏水性较高。含有10个半胱氨酸,假设全部形成二硫键时,280nm处的摩尔消光系数为53455(mol・cm)-1,0.1%浓度(1g/L)的吸光度(A280)为0.872;假设二硫键全部打开时,280nm处的摩尔消光系数为52830(mol・cm)

-1

斑马鱼(Daniorerio)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、牛(Bos

taurus)、大西洋鲑(SalmoSalar)、鸡(Gallusgallus)、人类(Homosapiens)、黑脚硬蜱(Ixodesscapularis),爪蟾(Xenopus(Silurana)tropicalis)、小白鼠(Musmuscu2

lus)、扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)的基因进行

蛋白序列比对(图2)。

在14～21和121～125的位置存在明显的保守区域,各物种都为稳定的表达,蛋白比对的一致性为45.75%。

0.1%浓度(1g/L)的吸光度(A280)为0.862。在酵

母和大肠埃希菌中表达的半衰期分别大于20h和10h,在哺乳动物网状细胞体外培养中表达的半衰期为30h。

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图2　DAZ基因的氨基酸多重序列比对

Fig.2AminoacidmultiplesequencealignmentofDAZgene

图3　DAZ基因的亲水性预测

Fig.3HydrophilicitypredictionofDAZgene

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2.4　DAZ基因结构的特征性序列、蛋白质

的拓扑结构和二级结构

通过MotifScan(http://myhits.isb2sbi.ch/cgi2bin/motif_scan)在线预测DAZ基因有4个N-糖基化位点,分别位于碱基的:45～48,404～407,507～510,554～557位;1个氨基葡聚糖附着位点位于碱基的51～54位;5个蛋白激酶C磷酸化位点,分别位于碱基的:47～49,69～71,112～114,474～476,529～531位;12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,分别位于碱基的:2～5,188～191,194～197,208～211,237～240,248～251,468～471,474～477,508

～511,512～514,523～526,534～537位;1个酪氨酸激酶磷酸化位点位于碱基的531～538位;10个N2十四(烷)酰化位点,分别位于碱基的:6～11,16～21,199～204,225～230,244～249,279～284,254～259,460～465,479～484,555～560位;1个推定的真核核糖核蛋白(RNP)标记的RNA结合区位于碱基的138～145位。Htm预测该蛋白有1个跨膜区域(图4),位于碱基的265～288位;Sec预测α螺

β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分别为旋(H)、

15.48∶12.46∶72.06,二级结构以无规卷曲(L)为主,没有二硫键结合位点。

图4　DAZ基因的跨膜区域预测

Fig.4TransmembraneregionpredictionofDAZgene

2.4.5　DAZ基因的三级结构建模

DAZ基因三级结构建模如图5所示,模型的构

建从5～175aa,和其他蛋白的序列最高一致性达到

32%,Evalue值为2.9E-22。

图5　DAZ基因三级结构预测

Fig.5TertiarystructurepredictionofDAZgene

3　讨论

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因在线比对分析属于RRM超家族,与精子的发育、雄性的生殖有关。同其他物种DAZ基因进行氨基酸多重序列比对时,

在14～21和121～125的位置存在明显的保守区域,各物种都为稳定的表达,蛋白比对的一致性为45.75%。这为我们利用扩展莫尼茨绦虫生殖器官作为模式来研究其它物种相同器官的发育和病变机理提供了基础。目前男性不育症是医学界关注的重要问题之一,大约有10～15%的已婚夫妇不能生育,其原因多种多样,其中精子质量和无精子症基因(DeletedinAzoospermia,DAZ)是2个重要因素[6]。而且也有文献报道DAZ基因与男性不育相关,它主要调控早期生殖细胞的增殖。DAZ基因簇完全或部分缺失可导致10%不育男性的生殖细胞减少[7]。DAZ基因家族所有成员只在生殖细胞表达[8],但是具体的表达机制还不清楚,我们对扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的研究可以为研究人类DAZ基因提供模式生物方面的资料。

随着辅助生育技术的发展与ICSI技术的日益成熟,使严重生精障碍不育患者也能生育后代。可

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以预见,在接受ICSI的夫妇中,越来越多的严重寡

精症患者将被作为精子供体,而研究已表明,精子供体的异常遗传物质可能传递给下一代[9,10],所以寻找有效方法检测严重寡精症患者将是一项关系后代的严峻任务。但是从研究材料和伦理道德方面看我们不可能直接用人来进行试验,必须选择一类来源方便并且基因同源性较高的模式生物进行研究。我们通过对扩展莫尼茨绦虫DAZ基因进行序列,发现其与人类的DAZ基因有高度的同源性,存在稳定的保守序列。对扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的分析和功能预测,更具有了现实的意义。

扩展莫尼茨绦虫该蛋白理论分子量为61.3169kDa,等电点为4.77,不稳定系数50.27,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472,蛋白总体疏水性较高而且很不稳定。4个N2糖基化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,10个N2十四(烷)酰化位点,1个推定的真核核糖核蛋白(RNP)标记的RNA结合区。Htm预测该蛋白有1个跨膜区域,Sec预β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分测α螺旋(H)、

别为15.48∶12.46∶72.06,二级结构以无规卷曲(L)为主。没有二硫键结合位点,三级结构建模对DAZ基因的空间构型进行了形象的预测。这些蛋白功能位点和结构预测不但说明该条基因有多个功能位点,而且为后续研究DAZ基因的功能域结构指明了方向。

我们在本实验中得到的DAZ基因,通过和其他物种DAZ基因的蛋白序列比对发现了几个稳定表达的保守序列。DAZ是激活精子生成和保持种族Y染色体功能的重要基因,我们可以利用扩展莫尼茨绦虫发达的生殖系统作为模式生物研究其他物种的生殖疾病。以上结果表明,我们成功获得了扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的全长cDNA序列,并对其cDNA序列和编码蛋白进行B生物信息学分析,

从而为该基因功能的实验性鉴定工作奠定了基础。参考文献:

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