毕业设计论文
肉鸽致病菌的分离与分子生物学
鉴定
教学单位: 化学与生物工程学院 专业名称: 生物技术（生物制药）
学 号: 28060101021 学生姓名: 付涛 指导教师: 李雪雁 指导单位: 化学与生物工程学院 完成时间: 2012.4.30
电子科技大学中山学院教务处制发
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 摘要
肉鸽致病菌的分离与分子生物学鉴定
【摘要】 实验通过对患有沙门病的乳鸽病灶样本进行研磨、溶解、稀释、选择培养等操作后，分离出单一的沙门氏菌菌落，对这些菌落进行纯化培养，通过观察菌落形态特征、培养特性结合血清型鉴定结果以及生化实验结果对菌种进行初步判断。通过提取沙门氏菌基因组DNA，利用聚合酶链式反应对病鸽沙门氏菌的16SrDNA片段进行克隆，所得特异性片段以琼脂糖为介质进行电泳并与DNA marker对比确定所克隆DNA片段大小，初步判断是沙门氏菌16SrDNA片段。对片段测序并与GenBank中的序列进行比对，确定获得了鸽子沙门氏菌的分离菌株。 【关键词】 鸽子，沙门氏菌，分离筛选，生化实验，PCR
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） Abstract
Isolation and Molecular Biology
Identification of Pathogenic bacteria from
Pigeons
【Abstract】By grinding, dissolution, dilution, selection, cultivation and other operations on pigeon lesion samples with Salmonella disease,the experiment isolates a single colony of Salmonella and these bacteria are purified and cultured. By observing the colony morphology characteristics and cultured characteristics,combined with the result of the theseroty and biochemical test,the preliminary judgment of the strains can be made. By extrating Salmonella genomic DNA and using the polymerase chain reaction on Bingge to clone Salmonella 16SrDNA fragments,with the agarose as a medium,the specific fragment attained from the above is on electrophoresis and the comparation with the DNA Marker,to determine the cloned DNA fragment size,from which the preliminary judgment is the Salmonella 16SrDNA fragment. By sequencing the fragments and alignning them with the sequence in GenBank, pigeon Salmonella 16SrDNA specific sequences are obtained by sequencing of the company. As the result, the separated strains of the Salmonella from pigeon can be carried out through this experimental identification. 【Key Words】Pigeon，Salmonella，Isolation and Screening，Biological and chemical experiments，PCR
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 目录
目录
第1章前言 ............................................................................................................................. 1
1.1中山市肉鸽 ............................................................................................................... 2 1.2鸽子沙门氏菌病的危害 ........................................................................................... 2 1.3有关鸽子沙门氏菌菌种以往研究 ........................................................................... 2 1.4 16SrDNA特异性片段及鸽子沙门氏菌分子生物学鉴定的以往研究 .................. 2 第2章病鸽的采样与处理 ..................................................................................................... 4
2.1鸽子的采样 ............................................................................................................... 4 2.2鸽子的处理 ............................................................................................................... 4 2.3肉鸽致病菌的分离与筛选 ....................................................................................... 5
2.3.1 菌种悬液的制备 ........................................................................................... 5 2.3.2 浓度梯度稀释 ............................................................................................... 5 2.4菌种的分离与纯化 ................................................................................................... 6
2.4.1 选择培养基的配制 ....................................................................................... 6 2.4.2 涂布平板 ....................................................................................................... 7 2.4.3 划线分离 ....................................................................................................... 7 第3章病鸽致病菌的初步鉴定 ............................................................................................. 9
3.1菌种的形态结构观察 ............................................................................................... 9
3.1.1 革兰氏染色 ................................................................................................... 9 3.1.2 鞭毛染色 ..................................................................................................... 10 3.2菌落的培养特性 ...................................................................................................... 11
3.2.1 菌落特征 ...................................................................................................... 11 3.2.2 半固体穿刺实验 .......................................................................................... 11 第4章生物化学实验鉴定 ................................................................................................... 13
4.1糖发酵实验原理 ..................................................................................................... 13 4.1.1 葡萄糖发酵实验 ......................................................................................... 13 4.1.2 乳糖发酵实验 ............................................................................................. 15 4.2大分子物质水解实验 ............................................................................................. 16
4.2.1 淀粉水解实验 ............................................................................................. 16 4.2.2 油脂水解实验 ............................................................................................. 17 4.2.3 尿素琼脂实验 ............................................................................................. 19 4.3生物化学实验鉴定 ................................................................................................. 20
4.3.1 甲基红实验 ................................................................................................. 20 4.3.2 三糖铁实验实验 ......................................................................................... 21 4.3.3 西蒙氏柠檬酸实验 ..................................................................................... 22 4.3.4 赖氨酸铁琼脂实验 ..................................................................................... 23 4.3.5 动力吲哚鸟氨酸实验 ................................................................................. 24
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 目录
第5章血清型实验鉴定 ....................................................................................................... 26
5.1沙门氏菌的抗原结构 ............................................................................................. 26 5.2沙门氏菌A-F群“O”多价诊断 ......................................................................... 26 5.3沙门氏菌“Vi”血清诊断 ..................................................................................... 27 第6章致病菌的分子生物学鉴定 ....................................................................................... 28
6.1菌种的增菌培养 ..................................................................................................... 28 6.2 DNA的提取分离 ................................................................................................... 28 6.3聚合酶链式反应克隆特异性片段 ......................................................................... 30 6.4凝胶电泳 ................................................................................................................. 32 6.5测序及结果初步分析 ............................................................................................. 34 结论 ....................................................................................................................................... 36 参考文献 ............................................................................................................................... 37 附录 ....................................................................................................................................... 39 致谢 ....................................................................................................................................... 41
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 图目录
图目录
图2.1 病鸽样本 ............................................................................................................. 4 图2.2 从病鸽中取出的病灶部位 ................................................................................. 5 图2.3 平板涂布筛选结果 ............................................................................................. 7 图2.4 划线分离筛选结果 ............................................................................................. 8 图3.1 沙门氏菌的革兰氏染色 ................................................................................... 10 图3.2 镜检结果 ............................................................................................................ 11 图3.3 典型菌落 ............................................................................................................ 11 图3.4 半固体穿刺实验 ............................................................................................... 12 图4.1 葡萄糖发酵实验 ............................................................................................... 14 图4.2 乳糖发酵实验 ................................................................................................... 15 图4.3 淀粉水解实验 ................................................................................................... 17 图4.4 油脂水解实验 ................................................................................................... 18 图4.5 尿素琼脂实验 ................................................................................................... 20 图4.6 甲基红实验 ....................................................................................................... 21 图4.7 三糖铁实验实验 ............................................................................................... 22 图4.8 西蒙氏柠檬酸实验 ........................................................................................... 23 图4.9 赖氨酸铁琼脂实验 ........................................................................................... 24 图4.10动力吲哚鸟氨酸实验 ...................................................................................... 25 图5.1 沙门氏菌A-F群“O”多价诊断结果 ................................................................ 27 图5.2 沙门氏菌“Vi”血清诊断结果 ........................................................................... 27 图6.1 PCR产物凝胶电泳成像图及标准DNA Marker条带 .................................... 33
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 表目录
表目录
表2.1 亚硫酸铋基础培养基成分 ................................................................................ 6 表2.2 亚硫酸铋指示剂成分 ........................................................................................ 6 表3.1 半固体穿刺实验培养基成分 .......................................................................... 12 表4.1 葡萄糖发酵培养基试管成分 .......................................................................... 14 表4.2 乳糖发酵管成分 .............................................................................................. 15 表4.3 淀粉水解实验培养基 ...................................................................................... 16 表4.4 固体油脂培养基成分 ...................................................................................... 18 表4.5 尿素琼脂培养基 .............................................................................................. 19 表4.6 生化实验结果 .................................................................................................. 25 表6.1 LB增菌培养液成分 ......................................................................................... 28 表6.2 聚合酶链式反应体系 ...................................................................................... 31 表6.3 聚合酶链式反应条件 ...................................................................................... 32
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第1章 前言
第1章 前言
1.1中山市肉鸽
中山地区历来有养鸽的习惯，由于地处侨乡，一些华侨从国外引进优良鸽种，与本地优良鸽种杂交，在中山比较讲究的乳鸽饲养方式下，培育出的乳鸽以体型大、胸肉厚、肌肉饱满、肉质嫩滑爽口而饮誉身港澳市场。乳鸽中含有丰富的蛋白质、多种氨基酸以及禽类珍稀的软骨素还有十多种微量元素[1]。乳鸽作为中山的名菜，除色香味俱全外，还可用于药用食用，因乳鸽肉性温平，入肾肺，有治疗肺肾伤损久患虚亏功效，亦可治疗皮肤恶疮顽癣、疯癫溃疡，所以中山乳鸽菜式历久不衰，闻名珠三角地区。
1.2鸽子的沙门氏菌危害
鸽子沙门氏菌以副伤寒（Paratyphoid）为主，成年鸽子感染后通常不会有明显的临床症状，但在幼鸽身上常会造成急性病或是死亡。鸽子副伤寒病原是Salmonella typhimurim var copenhagen（沙门氏菌哥本哈根变种）[2,3]，此病潜伏期可长达1-2周，平均为10-14天。症状与“伤寒”十分相似，当相比于伤寒，此病的病症更重，死亡率亦较高。
鸽病病原菌在鸽群中传播的非常快，病鸽呈精神不振、食欲下降、羽毛膨松、关节肿大发炎、肛门污秽、绿色下痢便、神经症状包括翼下垂、身体失去平衡、斜颈等症状。
急性感染者大部分二至三天死亡，抵抗力较好的将成为耐过者。耐过病鸽虽然不会死亡但可成为带菌者，病鸽外观看起来正常，但在粪便中、鸽乳中、鸽巢、鸽蛋可能有病菌污染，成为其他健康鸽子的感染来源。此外沙门氏菌可以生存在鸽子的卵巢，并可以穿过蛋壳在卵内增值，造成胚胎的死亡或者发育停止，从而影响孵化率。其次，大部分的保菌蛋可以有抗体的保护，但在孵出后的2至3周
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第1章 前言
内因败血症而死亡，经过感染后没有造成死亡乳鸽也会变成耐受者而成为保菌鸽种。沙门氏菌亦可通过呼吸道或消化道引起鸽群的感染。沙门氏菌同样对人类的健康有极大危害的一类致病菌[4]。传染给人亦会引起伤寒、副伤寒和急性肠胃炎等疾病[5]。
1.3有关鸽子沙门氏菌菌种以往研究
沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。因1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。
在以往的研究中，康凯曾在《鸽副伤寒的病原鉴定》中讲到以北京市某肉鸽养殖场中以鸽子肝脏为样本分离出一株沙门氏菌，经鉴定为鼠伤寒哥本哈根变种，并获得了菌种形态相关信息以及部分生化特征[6]。在《山东畜牧兽医》中，赵磊在《信鸽沙门氏菌的诊治》中详尽的阐述了患病鸽的临床症状，同时也描述了其分离菌种的培养特性[7]。本实验以中山市某肉鸽场病鸽的肝脏以及小肠病灶为样本，利用亚硫酸铋选择培养基筛选出单一的沙门菌落，通过参考文献对比所提菌落的菌落形态，培养特性、生化实验结果以及血清鉴定结果，初步判定是否为目标菌种，为下一步分子生物学的鉴定奠定基础。
1.4 16SrDNA特异性片段及鸽子沙门氏菌分子生物学鉴定的以往研究
细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子[8]。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第1章 前言
列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便 [9] 。
在以往的研究中，关于沙门氏菌的研究主要集中在食品安全领域和鸡鸭牛等家畜类上，研究的内容主要以其生化特征以及血清型鉴定为主。在以鸽子为样品的实验中，吴宏新等人曾在《一起鸽子感染沙门氏菌病的诊治体会》中谈到关于鸽子患沙门病后的症状，并对其致病菌种进行了分离纯化，完成了生化实验和药敏实验[10]。赵伟光等人在《鸽场大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定及其药敏实验》详细的讨论了鸽子中沙门氏菌糖发酵实验和药敏实验[11]。在以往以沙门氏菌16S rDNA进行克隆的实验中，马广强、王宏梅等人从牛中提纯沙门氏菌，并完成了16SrDNA的克隆及测序工作，所得序列大小为1441bp[12]。本实验以鸽子为样本从中提纯沙门氏菌致病菌，通过病鸽病症特点、生化实验进行初步验证，并首次完成了对其16S rDNA的克隆及测序工作。并将获得的菌株16SrDNA特异性序列与从Genbank数据库中获得的沙门氏菌的16SrDNA序列用DNASTAR软件中的MegAlign进行多序列匹配排列。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第2章 病鸽的采样与处理
第2章 病鸽的采样与处理
2.1鸽子的采样
实验组成员从中山市某鸽场采集病鸽、选取刚刚孵化出1至10天左右的带病活体幼鸽，选取的幼鸽有腹部膨满、体质虚弱、嗜眠且外观出现神经症状，精神萎顿，羽毛无光泽[13]。
图2.1病鸽样本
2.2鸽子的处理
实验器材：无菌操作工作台、灭菌托盘、灭菌手术刀、灭菌培养皿、灭菌研钵、灭菌棉签。
实验样本：肉鸽病变心脏、肝、肠。
实验方法：实验前打开实验室紫外灯15至20min，将所采样的鸽子用自来水冲洗至表面无杂物，在无菌操作工作台中，在实验鸽腹部用75%的酒精进行消毒，使用灭菌手术刀进行解剖，小心取出鸽子肝脏部位，采样鸽子肝脏呈现水肿，颜色呈墨色，并带有恶臭气味。肝脏切碎后研磨，研磨物放置在培养皿中。另外取
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第2章 病鸽的采样与处理
鸽子盲肠部位，将盲肠内容物挤出至培养皿中。
图2.2从病鸽中取出的病灶部位
2.3肉鸽致病菌的分离与筛选
2.3.1菌种悬液的制备
实验器材：灭菌试管、灭菌玻璃棒、灭菌镊子、灭菌研钵、灭菌胶头滴管、无菌操作平台。
实验试剂：灭菌水。
实验方法：取少量肝脏研磨物及肠容物，分别置于无菌试管中，放入灭菌水至没过样本，充分振荡，使样本充分分散，静置20min，即为菌种悬液。
2.3.2浓度梯度稀释
实验目的：通过稀释菌种悬浊液，找到合适的分离浓度。 实验器材：灭菌移液管（1ml），无菌试管。 实验试剂：菌种悬液、灭菌水。
实验方法：用移液管移取1ml菌种悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成101、102、103、104、105不同稀释度的菌种悬液。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第2章 病鸽的采样与处理
2.4菌种分离与纯化
2.4.1选择培养基的配制
选择培养基制备原理：蛋白胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质；葡萄糖提供能源；亚硫酸铋指示剂抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，但不影响沙门氏菌的生长；磷酸氢二钠是缓冲剂；硫酸亚铁用于产生硫化氢，并与铁产生沉淀，使阳性培养物为具有金属光泽的棕色到黑色菌落；琼脂是培养基的凝固剂。
亚硫酸铋选择培养基的制备：称取基础培养基39.3g（配制方法见表2.1），加入蒸馏水或去离子水950ml，搅拌加热煮沸至完全溶解；称取亚硫酸铋指示剂8g（25℃，pH=7.4 ± 0.1，配制方法见表2.2），加入蒸馏水或去离子水50ml，隔水加热至50℃左右溶解，在无菌环境中，将5ml亚硫酸铋指示剂溶液加入以冷至50℃左右的95ml亚硫酸铋基础培养基中，倾注灭菌培养皿，待凝固后，备用。
表2.1 亚硫酸铋基础培养基成分 亚硫酸铋基础培养基成分 成分 蛋白胨 牛肉浸粉 硫酸亚铁 磷酸氢二钠 葡萄糖 琼脂
含量/L 10g 5g 0.3g 4g 5.0g 20.0 g
表2.2 亚硫酸铋指示剂成分 亚硫酸铋指示剂成分 成分 亚硫酸铋 煌绿 柠檬酸铋铵
含量/L 8g 0.025g 20.0g
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第2章 病鸽的采样与处理
2.4.2涂布平板
实验原理：将一定浓度，一定量的待分离菌悬液加到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，使长出单菌落或菌苔而达到分离的目的。
实验器材：涂布棒、酒精灯、灭菌移液管（1ml）、培养皿、恒温培养箱。 实验试剂：不同梯度的菌种悬液、灭菌水、亚硫酸铋选择培养基。
实验方法：将稀释倍数分别为103、104、105的菌种溶液涂布到亚硫酸铋培养基上，盖上皿盖，倒置在恒温培养箱中37℃条件下培养18-24h。
实验结果：获得单一的菌落，见图2.3。
图2.3 平板涂布筛选结果
2.4.3划线分离
实验原理：平板划线分离法是把混杂在一起的微生物或一微生物群体中的不同细胞，通过一在固体培养基平板表面作多次的由点到线的划线稀释，从而得到许多独立分布的细胞，再经适当培养后，每一细胞就发展成一个菌落。由于每一菌落一般是由一个细胞繁殖而成的子细胞集团，因而通常就把一个单菌落作为某一微生物的“纯种”。
实验器材：酒精灯、接种环、培养皿、恒温培养箱。
实验方法：将涂布出来的菌种分别在静置12h的亚硫酸铋培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温培养箱中培养37℃条件下18-24h。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第2章 病鸽的采样与处理
实验结果：成功的对单一菌落进行了分离，见图2.4。
图2.4 划线分离筛选结果
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第3章 乳鸽致病菌的初步鉴定
第3章 乳鸽致病菌的初步鉴定
3.1菌落的形态结构观察
3.1.1革兰氏染色
实验原理：由于未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。经革兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征。
细菌通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，对于革兰氏阴性菌，因其有细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄，交联度差的特点，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能够阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色；而革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物稳固结合并使其留在壁内，故任呈现为紫色。
实验器材：接种环、干净玻璃片、酒精灯、吸水纸、显微镜。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、结晶紫（初染剂）、碘液（媒染剂）、酒精（脱色剂，浓度为95%）、番红（复染剂）、蒸馏水。
实验方法：1.制片，将筛选出的单一菌落抹于玻片上，并置于酒精灯上加以热固定。
2.结晶紫初染，将结晶紫滴于玻片上，静置1.5min后用蒸馏水洗去多余的结晶紫。
3.碘液媒染，将碘液滴于玻片上，静置1min后，用蒸馏水洗去多余的碘液。 4.酒精脱色，直至无结晶紫的颜色流出为止。
5.番红复染，约1.5min后用蒸馏水洗去。用洗水纸将多余的水吸干后，置于
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第3章 乳鸽致病菌的初步鉴定
显微镜下观察。
实验结果：经过染色后，所纯化的菌种在显微镜下观察到为红色，是革兰氏阴性杆菌。符合沙门氏菌的特征[14]。镜检结果见图3.1。
图3.1 沙门氏菌的革兰氏染色
3.1.2鞭毛染色
实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，通常的处理是在染色前先用媒染剂处理使其沉积在鞭毛上，达到加粗鞭毛直径目的，然后才进行染色。由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等可以配制出常用的媒染剂。细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。如果只需查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。
实验器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、镊子、接种环，显微镜。。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、鞭毛染色液A液与B液、灭菌水、香柏油、显微镜擦拭液。
实验方法：1.载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的污渍。
2.制片：在载玻片一端滴一滴清水，用接种环从斜面培养物种蘸一两下，再在清水中蘸一两下，然后倾斜玻片，使液体缓慢流向载玻片另一端，用吸水纸洗去多余液体，自然干燥。
3.染色：滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3~5min后用蒸馏水充分洗去A液。用
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第3章 乳鸽致病菌的初步鉴定
硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面40~50秒，其间用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。
4.镜检：用油镜镜检观察。
实验结果：经鞭毛染色后，在油镜下观察到菌种周边为灰褐色，实验结果为阳性，所得菌种有鞭毛。符合沙门氏菌的特征。镜检结果见图3.2。
图3.2 镜检结果
3.2菌落的培养特性
3.2.1菌种特征
在亚硫酸铋选择培养基上，所筛选出的沙门氏菌菌落呈圆形，菌落中心为黑色，有金属光泽，菌落周围培养基呈灰褐色，不透明，菌落略微隆起且周围边缘光滑，见图3.3。菌种培养特性符合沙门氏菌在亚硫酸铋选择培养基菌落特征。
图3.3 典型菌落
3.2.2半固体穿刺实验
实验原理：半固体培养基是在液体培养基中加入少量凝固剂是培养基呈半固体状态。利用穿刺实验，经培养后可以用来观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第3章 乳鸽致病菌的初步鉴定
菌体的效价等方面。
实验器材：酒精灯、接种针、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、半固体穿刺实验培养基，配制方法见表3.1。
表3.1 半固体穿刺实验培养基成分 半固体穿刺实验培养基成分
成分
含量 10g 3g 5g 4g 1000mL
蛋白胨 牛肉浸粉 氯化钠 琼脂 蒸馏水
培养基制备：将相关试剂按表3.1含量配制，调整pH=7.4±0.1，分装至小试管中，121℃下灭菌15 min，备用。
实验方法：1.培养基试管的制备：将制配好的半固体培养基倒入试管中灭菌后，垂直放置待凝。
2.接种：将各菌种用接种针挑取菌种，分别穿刺接种于准备好的半固体培养基中，在37℃恒温箱中培养24h。
3.观察：观察细菌生长范围并记录，判断细菌是否有运动性。
实验结果：观察到穿刺线不明显，对光可看到培养基浑浊度，细菌沿穿刺线扩散生长，为动力阳性菌种。见图3.4。
图3.4 半固体穿刺实验
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
第4章 生物化学实验鉴定
4.1糖发酵实验原理
实验原理：不同微生物对各种碳源的利用能力各不相同，其原理在于不同微生物拥有不同的酶系。并且绝大多数细菌都能将糖类作为碳源，但是它们之间在分解糖类物质的能力上存在着差异。有些细菌可以分解某种糖产生气体（如二氧化碳、甲烷、氢气等），有些细菌可以分解某种糖产生有机酸（如醋酸、乳酸、丙酸等）和，有些细菌只产酸不产气。
溴甲酚紫是一种酸碱指示剂，在中性时呈现为紫色，碱性时呈现为深红色，而在酸性时呈现黄色。由于微生物在进行碳源代谢时代谢产物的不同，对于有气体产生的菌落，通过观察徳汉氏小管中的气泡产出情况可以获知。而对于酸性物质的产物。随着酸性物质的积累可能导致超出培养基的缓冲范围，致使pH下降，从而引起溴甲酚紫的颜色由紫色转为黄色。若碳源代谢的终产物为中性化合物，既无颜色变化也无气体产生，表明此时的代谢较为复杂。
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。例如大肠埃希菌能发酵葡萄糖和乳糖；而伤寒沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽相同，如大肠埃希菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2，故产酸并产气；而伤寒沙门菌缺乏该酶，发酵葡萄糖仅产酸不产气[15,16]。
4.1.1葡萄糖发酵实验
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、葡萄糖发酵培养基，配制方法见表4.1。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
表4.1 葡萄糖发酵培养基试管成分 葡萄糖发酵培养基试管成分 成分 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
葡萄糖 琼脂 蒸馏水
含量 10g 3g 5g 1mL 10g 3g 1000mL
培养基制备：将蛋白胨、牛肉膏和氯化钠加入于水中，校正pH=7.4±0.1后加入琼脂加热溶解，再加入指示剂和葡萄糖，分装小试管，121℃下灭菌20 min后备用。
实验方法：1.将葡糖糖培养基等量的分装于试管中且内装充满培养基倒置的德汉氏试管中。然后将葡萄糖发酵管在121℃的高压蒸汽灭菌20分钟。
2.将灭菌好的发酵管，用记号笔进行标记。
3.取葡萄糖发酵管5支，无菌操作用烧红冷却的接种环将疑沙门氏菌接种于培养基试管中，第5支不接种，作为对照。在接种后，轻轻缓慢摇动试管，使其混合均匀。
4.将接种过好的试管和空白对照的试管放置37℃恒温箱中培养24~48h。 5.取出发酵试管，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，记录实验结果并拍照。
实验结果：徳汉氏小管内出现气泡，结果证明所得菌种可以利用葡萄糖，呈阳性，符合沙门氏菌特征。见图4.1。
图4.1 葡萄糖发酵实验
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4.1.2乳糖发酵实验
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、乳糖发酵培养基，配制方法见表4.2。
表4.2 乳糖发酵管成分 乳糖发酵管成分
成分 蛋白胨 乳糖
0.04%溴甲酚紫水溶液
含量/L 20g 10g 25mL
培养基制备：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH=7.4±0.1后加入指示剂加热溶解，分装至小试管，121℃下灭菌20min后备用。
实验方法：1.将乳糖培养基等量的分装于试管中且内装充满培养基倒置的德汉氏试管中。然后将乳糖发酵管在121℃的高压蒸汽灭菌20分钟。
2.将灭菌好的发酵试管，用记号笔进行标记。
3.取乳糖发酵发酵管5支，无菌操作用烧红冷却的接种环将疑沙门氏菌接种于发酵试管中，第5支不接种，作为空白对照。在接种后，轻轻缓慢摇动试管，使其混合均匀。
4.将接种过好的发酵试管和空白对照的试管放置37℃恒温箱中培养24~48h。 5.取出培养基试管，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，记录实验结果并拍照。
实验结果：徳汉氏小管内未出现气泡，结果证明所得菌种无法利用乳糖，呈阴性，符合部分沙门氏菌的特征。见图4.2。
图4.2 乳糖发酵实验
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4.2大分子物质水解实验原理
实验原理：微生物不能直接利用大分子的淀粉和脂肪，但微生物可以吸收利经胞外酶分解的大分子物质。胞外酶一般为水解酶，通过加水将大的物质裂解为较小的化合物，然后才能被运输至细胞内。如脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；淀粉酶水解淀粉为小分子的单糖和双糖、糊精等。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。淀粉实验中通过低价碘液观察细菌菌落周围是否产生蓝色来判断，细菌水解淀粉的区域，用碘测定不会产生蓝色，进而表明细菌产生淀粉酶。
尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物。尿素酶能分解尿素释放出氨，这是一个分辨细菌很有用的诊断实验。许多微生物都可以产生尿素酶，对比变形杆菌属(Proteus)的细菌，其利用尿素的速度要慢，因此尿素酶实验可以用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分变形杆菌属成员。
尿素琼脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚红。而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养基的pH升高，使pH=6.8时为黄色得酚红，在pH上升至8.4时转变为深粉红色；
4.2.1淀粉水解实验
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、淀粉水解实验培养基，配制方法见表4.3。
表4.3 淀粉水解实验培养基 淀粉水解实验培养基
成分 蛋白胨 牛肉膏 NaCl 可溶性淀粉
含量/L 10g 5g 5g 5g
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淀粉水解实验培养基（续上表） 成分 琼脂 蒸馏水
含量/L 20g 1000ml
培养基制备：先把淀粉用少量水调成糊状，再加到融化好的培养基中，校正pH=7.4±0.1，121℃下灭菌15 min后备用。
实验方法：1.将灭菌后的淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右后无菌操作导入无菌的培养皿中，待凝固后得到淀粉培养基平板。
2.用记号笔在培养基平板的底部标明编号。
3.无菌操作用烧红冷却后的接种环挑取单个可疑的沙门氏菌菌落沙门氏菌接种于培养基表面的中心，其中一个平板不接种，作为对照。
4.将接种后的平板置于37℃恒温箱培养24~48h。
5.取出平板，打开平皿盖，向菌落滴加少量的碘液，轻轻旋转使碘液均匀铺满菌落周围平板，观察现象，若该细菌具有分解淀粉的能力，则菌落周围会出现无色透明圈，继而证明淀粉已经被水解。同时透明圈大小可表示测试菌株水解淀粉能力的强弱。
实验结果：菌落周围呈现无色、透明状，证明淀粉已被水解为阳性。见图4.3。
图4.3 淀粉水解实验
4.2.2油脂水解实验
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、固体油脂培养基，配制方法见表4.4。
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表4.4 固体油脂培养基成分 固体油脂培养基成分
成分 蛋白胨 牛肉膏 NaCl 香油或花生油 中性红（1.6%水溶液）
琼脂 蒸馏水
含量/L 10g 5g 5g 10g 10ml 20g 1000mL
培养基制备：校正pH=7.4±0.1，加入中性红是培养基成红色位置，121℃下灭菌15 min，分装时需不断搅拌，使油脂均匀分布在培养基中。
实验方法：1.将灭菌后的油脂培养基融化后，取出并充分振荡，使油脂均匀分布，无菌操作下倾入无菌的培养皿中，待凝固后制得油脂培养基平板。
3.用记号笔在平板的底部对培养基进行编号。
4.无菌操作下用烧红冷却后的接种环挑取可疑的沙门氏菌菌落接种于培养基培养基表面，其中一个平板不接种，作为对照。
5.将接种后的平板置于37℃恒温箱培养24~48h。
6.取出平板观察结果，注意观察平板上长菌的地方，如出现红色斑点，即说明脂肪已被水解，此为阳性反应。记录实验结果并拍照。
实验结果：菌落周围为乳白色，没有红色斑点出现，呈现阴性。见图4.4。
图4.4 油脂水解实验
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4.2.3 尿素琼脂实验
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、尿素琼脂培养基，配制方法见表4.5。
表4.5 尿素琼脂培养基 尿素琼脂培养基
成分 蛋白胨 氯化钠 葡萄糖 磷酸二氢钾 琼脂 0.4%酚红溶液 20%尿素溶液 蒸馏水
含量/L 1g 5g 1g 2g 20g 3mL 100mL 1000mL
培养基制备：将除尿素和琼脂以外的成分配好，校正pH=7.4±0.1后，加入琼脂，加热溶化并分装。121℃高压灭菌20min。当冷至50～55℃时，加入经除菌过滤的尿素溶液使尿素的最终浓度为2%。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。
实验方法：1.取尿素琼脂培养基试管三支用记号笔进行标记。
2.无菌操作下，用烧红冷却的接种针挑取可疑沙门氏菌菌落穿刺接种于各个生化试管，再用烧红冷却的接种环挑取可疑沙门氏菌菌落以“之”字划线接种于斜面。
3.将已接种好的培养基试管放于试管架置37℃温箱中培养24h。 4.取出试管观察培养基的变化情况，记录实验结果并拍照。
实验结果：培养管呈现为淡橙红色，证明分离菌种可以分解尿素。见图4.5。
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图4.5 尿素琼脂实验（局部）
4.3 生物化学实验鉴定
4.3.1 甲基红实验
实验原理：肠杆菌科各菌属均能发酵葡萄糖，分解葡萄糖过程中会产生丙酮酸，由于糖代谢的途径不同，通过进一步分解，会分别产生琥珀酸、乳酸、甲酸、醋酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH=4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为阳性结果。若分解葡萄糖时细菌产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH=6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、甲基红生化试管。 实验方法：1.取甲基红生化试管三支用记号笔进行标记。
2.无菌操作下，用烧红冷却的接种针挑取可疑沙门氏菌菌落穿刺接种于各个生化试管，对于有斜面的生化试管须用烧红冷却的接种环挑取可疑沙门氏菌菌落以“之”字划线接种于斜面。
3.将已接种好的培养基试管放于试管架置37℃温箱中培养18h-24h。 4.取出试管观察培养基的变化情况，记录实验结果并拍照。
实验结果：滴加甲基红后培养基呈红色，实验菌种分解葡萄糖产生丙酮酸，
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
呈现为阳性结果，见图4.6；
图4.6 甲基红实验（左图为阴性对照组，右图为阳性实验组）
4.3.2三糖铁琼脂实验
实验原理：三糖铁琼脂实验原理：三糖铁琼脂实验用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而对发酵乳糖的细菌，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，则为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、三糖铁琼脂生化试管。 实验方法：1.取三糖铁琼脂生化试管三支用记号笔进行标记。
2.无菌操作下，用烧红冷却的接种针挑取可疑沙门氏菌菌落穿刺接种于各个生化试管，对于有斜面的生化试管须用烧红冷却的接种环挑取可疑沙门氏菌菌落以“之”字划线接种于斜面。
3.将已接种好的培养基试管放于试管架置37℃温箱中培养18h-24h。 4.取出试管观察培养基的变化情况，记录实验结果并拍照。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
实验结果：三糖铁生化试管在培养一段时间后发现培养基底部有断层，试管斜面为黑色，在试管底部呈现为黄色，证明实验菌种产气，产酸，符合沙门氏菌特征，见图4.7。
后现象）
图4.7 三糖铁琼脂实验（左图为实验前培养基；中图为培养18h后现象；右图为培养24h
4.3.3西蒙氏柠檬酸实验
实验原理：当细菌可以利用磷酸二氢铵作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸钠作为唯一的碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸钠，生成碳酸钠，使培养基产碱变蓝色。氯化钠维持均衡的渗透压；镁离子是各种代谢中的辅因子；磷酸氢二钾是缓冲剂；溴麝香草酚兰为pH指示剂，酸性呈黄色，碱性呈蓝色。
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、西蒙氏柠檬酸生化试管。 实验方法：1.取西蒙氏柠檬酸生化试管三支用记号笔进行标记。
2.无菌操作下，用烧红冷却的接种针挑取可疑沙门氏菌菌落穿刺接种于各个生化试管，对于有斜面的生化试管须用烧红冷却的接种环挑取可疑沙门氏菌菌落以“之”字划线接种于斜面。
3.将已接种好的培养基试管放于试管架置37℃温箱中培养18h-24h。 4.取出试管观察培养基的变化情况，记录实验结果并拍照。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
实验结果：西蒙氏柠檬酸生化试管在接种实验菌种后培养一段时间呈现为绿色，表明实验菌株不分解柠檬酸，见图4.8。
养24h后现象）
图4.8 西蒙氏柠檬酸盐实验（左图为实验前培养基；中图为培养18h后现象；右图为培
4.3.4赖氨酸铁琼脂实验
实验原理：赖氨酸铁琼脂用于沙门氏菌生化实验(FDA标准)， 蛋白胨和酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖为可发酵的糖类；溴甲酚紫为pH指示剂；琼脂作为凝固剂。黄褐色为阴性，底部紫色则菌种含有赖氨酸脱羧酶，斜面红色则菌种含有脱氨酶。
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、赖氨酸铁琼脂生化试管。 实验方法：1.取赖氨酸铁琼脂生化试管三支用记号笔进行标记。
2.无菌操作下，用烧红冷却的接种针挑取可疑沙门氏菌菌落穿刺接种于各个生化试管，对于有斜面的生化试管须用烧红冷却的接种环挑取可疑沙门氏菌菌落以“之”字划线接种于斜面。
3.将已接种好的培养基试管放于试管架置37℃温箱中培养18h-24h。 4.取出试管观察培养基的变化情况，记录实验结果并拍照。
实验结果：赖氨酸铁琼脂生化试管在接种后培养一段时间呈现为紫色，证明实验菌株可以分解赖氨酸，见图4.9。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
图4.9 赖氨酸铁盐琼脂实验（左图为实验前培养基；右图为培养24h后现象）
4.3.5动力吲哚鸟氨酸实验
实验原理：具有鸟氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的鸟氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基与吲哚试剂的界面会变红有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、动力吲哚鸟氨酸生化试管。 实验方法：1.取动力吲哚鸟氨酸生化试管三支用记号笔进行标记。
2.无菌操作下，用烧红冷却的接种针挑取可疑沙门氏菌菌落穿刺接种于各个生化试管，对于有斜面的生化试管须用烧红冷却的接种环挑取可疑沙门氏菌菌落以“之”字划线接种于斜面。
3.将已接种好的培养基试管放于试管架置37℃温箱中培养18h-24h。 4.取出试管观察培养基的变化情况，记录实验结果并拍照。
实验结果：实验培养基呈紫灰色；穿刺线不明显，对光看细菌沿穿刺线扩散。表明实验菌株可以分解鸟氨酸且可以进行运动，见图4.10。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第4章 生物化学实验鉴定
培养24h后现象）
图4.10 动力吲哚鸟氨酸实验图（左图为实验前培养基；中图为培养18h后现象；右图为
表4.6 生化实验结果
实验类型
甲基红实验 三塘铁琼脂实
验 西蒙氏柠檬酸
实验 赖氨酸铁实验 动力吲哚鸟氨酸实验
实验现象
滴加甲基红后培养基呈红色 培养基有断层，斜面为黑色，
底部为黄色
培养基呈绿色 培养基呈紫色 培养基呈紫灰色；穿刺线不明显，对光看细菌沿穿刺线
扩散
结果
实验菌株分解葡萄糖产生丙酮
酸
实验菌株产气，产酸 实验菌株不分解柠檬酸 实验菌株分解赖氨酸 实验菌株分解鸟氨酸；实验菌
株有鞭毛运动
生 化 实 验
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第5章血清型实验鉴定
第5章血清型实验鉴定
5.1 沙门氏菌的抗原结构
沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面（Vi)抗原3种。
O抗原为脂多糖，性质稳定。能耐100℃达数小时，不被乙醇或0.1%石炭酸破坏。决定O型原特异性的脂多糖中的多糖侧链部分，将具有共同O抗原沙门氏菌归为一组，这样可将沙门杆氏菌属分为A～Z、O51～O63、O65～O67共有42组。中国已发现26个菌组、161个血清型。使人类致病的沙门氏杆菌大多属于a～e组。O抗原刺激机体主要产生lgm抗体。
Vi抗原因与毒力有关而命名为vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸组成。不稳定，经60℃加热、石碳酸处理或人工传代培养易破坏或丢失。新从患者标本中分离出的伤寒杆菌、丙型副伤寒杆菌等有此抗原。vi抗原存在于细菌表面，可阻止o抗原与其相应抗体的反应。vi抗原的抗原性弱。当体内菌存在时可产生一定量抗体；细菌被清除后，抗体也随之消失。故测定vi抗体有助于对伤寒带菌的检出。
5.2沙门氏菌A-F群“O”多价诊断
实验器材：干净的载玻片、接种环。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、沙门氏菌A-F群“O”多价诊断试剂。 实验方法：利用玻片凝集法，使用两片干净载玻片并做好标记，将沙门氏菌诊断血清型A-F多价0血清试剂滴一滴于其中一片，另一片点一滴生理盐水作为对照。从 2 4～36 h 经过培养的BS培养基， 用接种环分别挑取培养菌种， 移到两载玻片的溶液中混匀，将混合液前后倾斜移动1 min ， 并在良好照明下对着黑暗背景观察， 四周为透明、颗粒状、呈絮状的凝集块视为阳性反应。四周浑浊，
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第5章血清型实验鉴定
不透明视为阴性。
实验结果：菌体出现凝聚呈现阳性，对照组为浑浊。
图5.1 沙门氏菌A-F群“O”多价诊断结果
5.3沙门氏菌“Vi”血清诊断
实验器材：干净的载玻片、接种环。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、沙门氏菌“Vi”血清诊断试剂。 实验方法：利用玻片凝集法，使用两片干净载玻片并做好标记， 将沙门氏菌诊断血清型Vi因子试剂滴一滴于其中一片，另一片点一滴生理盐水作为对照。从 2 4～36 h 经过培养的BS培养基， 用接种环分别挑取培养菌种， 移到两载玻片的溶液中混匀，将混合液前后倾斜移动1 mi n ， 并在良好照明下对着黑暗背景观察， 四周为透明、颗粒状、呈絮状的凝集块视为阳性反应。四周浑浊，不透明视为阴性。错误！未找到引用源。
实验结果：菌体出现浑浊呈现阴性，对照组为浑浊。
图5.2 沙门氏菌“Vi”血清诊断结果
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第6章 致病菌的分子生物学鉴定
第6章 致病菌的分子生物学鉴定
6.1菌种的增菌培养
实验原理：LB（Luria-Bertani）增菌培养液是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养液，含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。
实验器材：酒精灯、接种环、试管、无菌操作台、称量纸、量筒、烧杯、玻璃棒、电子天平、高温高压灭菌锅、水浴恒温培养箱。
实验试剂：培养18-24小时的纯化菌种、LB增菌培养液，见表6.1。
表6.1 LB增菌培养液成分 LB增菌培养液的成分 成分 胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 蒸馏水
含量/L 10g 5g 10g 1000mL
培养基制备：用5mol/L NaOH校正pH=7.4±0.1，加入蒸馏水至1000ml，加热溶化并分装至试管中。121℃高压灭菌15min，备用。
实验方法：无菌条件下，用烧红冷却的接种环挑取选择培养基中的典型菌落至制备好的LB增菌培养液试管中，包扎后放入37℃的恒温水摇床中，增菌培养18h-36h，待见增菌培养试管变浑浊后取出，备用。
实验结果：LB增菌培养液试管中呈现浑浊。
6.2菌种DNA的提取分离
实验原理： CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。易溶于异丙醇，
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第6章 致病菌的分子生物学鉴定
可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
在CTAB提取缓冲液的经典配方中EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，可以抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解于液相中；而Tris-HCl (pH=8.0)可以提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。
用酚抽提细胞DNA时，可以使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚不仅有效变性蛋白质同时也抑制了DNase的降解作用。但是其亦能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA且不能完全抑制RNase的活性。利用氯仿来克服酚的缺点，同时加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的迹量酚。
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，异戊醇可以降低表面张力从而减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl ，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而使聚集沉淀更加容易。
实验仪器：恒温水浴锅、1.5mL的微量离心管、微量移液枪、台式高速离心机（12 000r/min）、水浴恒温培养箱。
实验试剂：TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH =8.0、1mmol/L EDTA ，pH=8.0)、10%（w/v)十二烷基硫酸钠（SDS)、20mg/mL蛋白酶K、5mol/mL NaCl、CTAB/NaCl溶液、氯仿/异戊醇溶液（24:1）、酚/氯仿/异戊醇溶液（25:24:1）、异丙醇、70%乙醇、RNase (核糖核酸酶A)、超纯水。
实验方法：1.取1.5mL培养液于1.5mL离心管中，12 000r/min离心30s，弃上清，收集菌体，吸干多余的水分。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 第6章 致病菌的分子生物学鉴定
2.菌体沉淀加入320μL TE溶液(10mmol/L Tris - HCl， 1mmol/L EDTA， pH=8.0) ，充分悬浮混匀菌体。
3.加入30μL 10%的SDS和5μL 20 g/L蛋白酶K，37 ℃水浴40min。 4.加入100μL 5mol/L的NaCL和80μL 50 g/L的CTAB溶液， 65 ℃水浴10min。 5.加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(质量比25∶24∶1) ，轻轻颠倒混匀， 4 ℃、12000 r/min，离心5min，重复以上步骤1次。
6.取上清，加入400μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，12 000 r/min、4 ℃条件下，离心10 min。
7.弃上清液，向离心管中加入70%乙醇，-20 ℃保存5min，12 000 r/min、4 ℃条件下，离心10 min。
8.将所得DNA沉淀溶于100μL去离子的无菌水中，-20 ℃条件下保存备用[17]。
实验结果：获得了纯度较高的菌种DNA片段。
6.3聚合酶链式反应克隆特异性片段
实验原理：聚合酶链式反应类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物[18,19]。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：首先，模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；然后模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；最后DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，随后新链又可以作为下次循环的模板。每次循环需2～5分钟， 1～3小时可以使将待克隆的基因扩增放大百万倍。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算，n为循环次数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数。平均扩增效率的理论值为100%，实际反应中平均效率无法达到理论值。反应前期，靶序列DNA片段的增加呈现为指数形式，但是由于PCR产物的逐渐积累，会出现“停滞效应”即被扩增的DNA 片段将再呈现线性增长或静止，这种效应称平台期数，由于PCR 扩增效率及非特异性产物的竟争及DNA
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聚合酶PCR的种类和活性等因素。一般情况下，平台期是不可避免的。而到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR扩增产物可分为短产物片段和长产物片段两部分。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，3' 端则没有固定的止点， 5'端是固定的，致使长短不一，这就形成长产物片段。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链结合。引物在与新链结时，由于新链模板的5'端序列是固定的，也就是等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。
实验试剂：无菌去离子水、引物I（F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、引物II（ R1492：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、dNTPS、10×buffer、TaqDNA 聚合酶（Taq酶:dNTP、10×buffer、MgCl2）。
实验器材：烧杯、高温高压灭菌锅、台式高速离心机、微量移液枪及枪头（10μl×1把、100μl×1把、 1000μl×1把及对应枪头若干）、PCR扩增仪、Eppenddorf管、Tip、PCR板。
实验方法：1.加样：按照体系加入以下试剂（体系组成见表6.2）于PCR 反应管内，混匀。
表6.2 聚合酶链式反应体系 反应体系: (体系体积50μl) 成分 10 × buffer
dNTP 引物1 引物2 Taq酶 模板DNA 无菌ddH2O
含量 5μl 5μl 1μl 1μl 1μl 1μl 36μl
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2.PCR反应条件：将反应管置于PCR仪中，设定程序[20,21]，程序参数见表6.3，待反应完成后取出产物。
表6.3 聚合酶链式反应条件 反应步骤 95 ℃预变性 94℃变性 55 ℃退火 72 ℃延伸
反应30个循环
72 ℃延伸
7min 反应时间 5min 30s 1min 1min
6.4凝胶电泳
实验原理：溴化乙锭作用原理：溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，使其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。所以在观察琼脂糖凝胶中DNA可以事先利用荧光染料溴化乙锭进行染色。
带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率，影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度。
DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
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本实验以琼脂糖为凝胶电泳介质。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度， DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复的特点，对于相同数量的双链DNA可视为具有等量的净电荷，因此能以同样的速度向电极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的构型和大小。琼脂糖凝胶电泳可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同的DNA片段。采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子。
实验器材：电泳仪、恒压调节器、凝胶成像系统。
实验试剂：DNA marker、Loading buffer、TBE 缓冲液、琼脂糖、EB染料。 实验方法：1.配胶：称取0.75g的琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50ml1×TBE缓冲液，置微波炉里加热至完全融化取出摇匀，待琼脂糖凝胶冷却至50℃时加入EB染料5μl，混匀，
2.倒胶，插入样品梳，聚合约半小时，拔去挡板、梳子和撕去透明胶封条。 3.电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面略高出凝胶面，放入凝胶板
4.将PCR产物管中加入溴酚蓝加样缓冲液（或者Loading buffer），在每个卡槽中加入5μl产物，选中间卡槽中加入DNA Marker 8μl。
5.连接电源，调整至恒压110V，电泳1h～2h。 6.将电泳完成的凝胶放在自动成像仪下成像拍照。
实验结果：电泳条带与DNA marker对照可知，所得沙门氏菌16S rDNA特异性片段大小约为1500bp，可以初步判定为沙门氏菌。
图6.1 PCR产物凝胶电泳成像图及标准DNA Marker条带（大小约为1500bp）
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6.5 测序及结果初步分析
将所得沙门氏菌16SrDNA特异性片段在冰袋中保存一同邮寄至上海英骏生物技术有限公司（广州分公司）Shanghai Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd（Guangzhou Office）进行测序，测序结果表明所得特异性片段大小为1381bp，序列如下： 1 ACACATGCAA GTCGAACGGT AACAGGAAGC AGCTTGCTGC TTCGCTGACG AGTGGCGGAC 61 GGGTGAGTAA TGTCTGGGAA ACTGCCTGAT GGAGGGGGAT AACTACTGGA AACGGTGGCT 121 AATACCGCAT AACGTCGCAA GACCAAAGAG GGGGACCTTC GGGCCTCTTG CCATCAGATG 181 TGCCCAGATG GGATTAGCTT GTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCGAC GATCCCTAGC 241 TGGTCTGAGA GGATGACCAG CCACACTGGA ACTGAGACAC GGTCCAGACT CCTACGGGAG 301 GCAGCAGTGG GGAATATTGC ACAATGGGCG CAAGCCTGAT GCAGCCATGC CGCGTGTATG 361 AAGAAGGCCT TCGGGTTGTA AAGTACTTTC AGCGGGGAGG AAGGTGTTGT GGTTAATAAC 421 CGCAGCAATT GACGTTACCC GCAGAAGAAG CACCGGCTAA CTCCGTGCCA GCAGCCGCGG 481 TAATACGGAG GGTGCAAGCG TTAATCGGAA TTACTGGGCG TAAAGCGCAC GCAGGCGGTC 541 TGTCAAGTCG GATGTGAAAT CCCCGGGCTC AACCTGGGAA CTGCATTCGA AACTGGCAGG 601 CTTGAGTCTT GTAGAGGGGG GTAGAATTCC AGGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATCTG 661 GAGGAATACC GGTGGCGAAG GCGGCCCCCT GGACAAAGAC TGACGCTCAG GTGCGAAAGC 721 GTGGGGAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GTCTACTTGG 781 AGGTTGTGCC CTTGAGGCGT GGCTTCCGGA GCTAACGCGT TAAGTAGACC GCCTGGGGAG 841 TACGGCCGCA AGGTTAAAAC TCAAATGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT 901 GTGGTTTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGTC TTGACATCCA CAGAAGAATC 961 CAGAGATGGA TTTGTGCCTT CGGGAACTGT GAGACAGGTG CTGCATGGCT GTCGTCAGCT 1021 CGTGTTGTGA AATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTATCC TTTGTTGCCA 1081 GCGATTAGGT CGGGAACTCA AAGGAGACTG CCAGTGATAA ACTGGAGGAA GGTGGGGATG 1141 ACGTCAAGTC ATCATGGCCC TTACGACCAG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGCGCATACA 1201 AAGAGAAGCG ACCTCGCGAG AGCAAGCGGA CCTCATAAAG TGCGTCGTAG TCCGGATTGG 1261 AGTCTGCAAC TCGACTCCAT GAAGTCGGAA TCGCTAGTAA TCGTGGATCA GAATGCCACG 1321 GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCATGGGAGT GGGTTGCAAA 1381 AGAAGTAGGT AGCTTAACCT TCGGGAGGGC GCTTACCA
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所得菌种16SrDNA测序结果与GenBank基因库进行配对，结果显示，从鸽子中提取的沙门氏菌16SrDNA特异性片段与副伤寒沙门氏菌16SrDNA片段的序列相似度为100%。依次可知，本实验成功地从鸽子分离到沙门氏菌，并获得了其16SrDNA特异性片段序列信息。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 结论
结论
本实验通过筛选来自于中山市某肉鸽培养基地病鸽，根据相关文献挑选出疑患沙门氏菌症的乳鸽。通过对其解剖，取出病灶部位，同时利用亚硫酸铋选择培养基对病灶中的菌种进行选择培养获得疑沙门氏菌，通过观察其菌落生长特性、培养特性结合糖酵解实验、大分子物质水解实验、生化实验以及血清型鉴定结果，结合参考文献初步判断为沙门氏菌并获得其相关培养特性。为进一步确定所得沙门氏菌的种属分类，并为对中山市肉鸽分子生物学方面的研究提供基础，本实验组利用CTAB法分离提纯DNA，获得纯度较高的DNA片段；结合细菌16SrDNA序列的保守性特点，实验组通过以引物I（F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、引物II（ R1492：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为上下游引物，利用聚合酶链式反应技术对所提沙门氏菌的16SrDNA片段进行克隆以获得纯度较高的特异性片段。在利用琼脂糖凝胶电泳技术对比DNA Marker通过成像仪可知所得菌落16SrDNA片段大小。最终测序结果与GenBank基因库匹配可知所提沙门氏菌16SrDNA序列与副伤寒沙门氏菌相同。
本实验首先通过鸽子沙门氏菌病症状筛选病鸽作为实验样本，其次通过选择培养、生化实验、血清型鉴定排除其他非目的菌种，并初步确定为沙门氏菌；最后利用分子生物学鉴定获知沙门氏菌种属信息。本实验为首次以鸽子为样本，获得了沙门氏菌的16SrDNA特异性序列信息。由于时间与精力有限，未对所得片段进行分析，希望以后的研究能以此实验所得结果为基础并可以利用所得片段信息能够对获得菌种进行进一步的改造与利用。
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 参考文献
参考文献
[1] 钟广福，毛战生，张焕荣等．以乳鸽为主要原料的系列口服营养制品[P]．中国专利，CN1103558，1995-06-14．
[2] 赵宝华．我国肉鸽疾病的发生现状[J]．中国家禽，2010，32(23)．
[3] Marija Vučemilo，Ksenija Vlahović，dr．sc．Prevalence ofCampylobacter jejuni， Salmonella typhimurium，and avianParamyxovirus type 1 (PMV-1) in pigeons from different regions in Croatia [J]．Zeitschrift für Jagdwissenschaft，2003，49．
[4] 张华．动物性产品中沙门氏菌的危害及控制措施[J]．中国动物保健，2004，6． [5]Mohammad Jahantigh．Hassan Nili．Prevalence of Campylobacter jejuni， Drug resistance of Salmonella spp．isolated from pigeon eggs [J]．Comparative Clinical Pathology ，2010，5．
[6] 康凯．鸽副伤寒的病原鉴定 [J]．中国兽药杂质，2003，37（2）． [7] 赵磊．信鸽沙门氏菌病的诊断[J]．山东畜牧医药，2010，31．
[8] 雷正瑜．16SrDNA序列分析在微生物分类鉴定中的应用[J]．湖北生态职业技术学院学报，2006，4（1）．
[9] S． I． Koh-Luar，S． T． Chew，E． Lau． Restriction fragment length polymorphism (RFLP) of Salmonella organisms[J]．World Journal of Microbiology & Biotechnology ，1996，12．
[10] 吴宏新，吴家富，龚筱丽等．一起鸽子感染沙门氏菌病的诊治体会[H]．畜牧兽医杂志，2011，30（6）．
[11] 赵光伟，郑琳红，张成伟等．鸽场大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定及其药敏试验[J]．养禽与禽病防治，2010，6．
[12] 马广强，杨少华，王宏梅等．通过16S rDNA全序列分析及鉴定牛沙门氏菌[J]．家畜生态学报，2006，27（6）．
[13] 金文杰，赵文明，刘岳龙．鸽沙门氏菌的分离鉴定[J]．中国禽业导刊，1999, 9． [14] 刘娟，吉文汇，润芳．鸡大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的分离鉴定及药敏试验研究[J]．畜禽业，2007，213（1）．
[15] 王建明．对肉鸽大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的诊断[J]．中国畜牧种业出版，
37
电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 参考文献
2011，7(8)．
[16] GB/T 4789．4-2010，食品安全国家标准食品微生物检验沙门氏菌检验[S]．北京：中华人民共和国卫生部，2010.
[17] 邵碧英，陈彬，汤敏英等．沙门氏菌DNA提取及PCR反应条件的优化[J]．食品科学，2007，28（7）．
[18] 郭闯，高原，王炜．动物性食品中沙门氏菌检测技术研究进展[J]．内蒙古名族大学学报，2008，23(3)．
[19] 黎敏英，邓树轩，叶朗光等．沙门氏菌检测方法研究进展[J]．畜牧与饲料科学，2009，30（3）．
[20] 余波，徐景峨，王璇等．鸽肠炎沙门氏病的诊断与防治[J]．上海畜牧兽医通讯，2011，5．
[21] 黄劲，王和．用PCR扩增16SrRNA基因鉴定甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株[J]．贵阳医学院学报，2006，31（4）．
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 附录
附录
附录A 沙门氏菌生化鉴定结果参照表
培养基 葡萄糖发酵实验 乳糖发酵实验 甲基红实验 淀粉水解实验 油脂水解实验 半固体穿刺实验 三塘铁实验 尿素实验 西蒙氏柠檬实验 赖氨酸铁实验
阴性组 无气泡 无气泡 黄色 变蓝 无红色斑点 沿线生长 底部红色 斜面红色 底部无气泡 无黑色 淡橙红色 绿色 黄褐色
赖氨酸脱氨酶：斜面红色
沿接种线生长
动力吲哚鸟氨酸实验
培养基变黄
主要仪器 恒温培养箱
电子天平 高温高压灭菌锅 无菌操作台 水浴恒温培养箱 恒温水浴锅 1.5mL的微量离心管
结果
阳性组 有气泡 有气泡 红色 无色 红色斑点 祢漫生长 底部黄色 斜面黄色 底部有气泡 黑色 玫瑰红-桃红
蓝色
赖氨酸脱羧酶b：底部紫色
培养时间（小时）
24-48
24-48 24-48 24-48 24-48 24-48 24 12-24 18-24 24-48
弥漫生长
18-24
培养基变灰紫色
附录B 实验主要仪器信息表
生产厂家 广东省医疗器械厂 上海天平仪器厂 上海博讯实业有限公司医疗设
备厂
苏州佳宝净化工程设备有限公
司 金坛市科析仪器有限公司 江苏金坛市宏华仪器厂 广州承越生物技术有限公司（广
州鼎国生物）
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型号 LRH-250-A JA1003 YXQ-LS-50S11 SW-CJ-IF SHA-B HH-6
电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 附录
微量移液枪 台式高速离心机 微量移液枪及枪头
PCR扩增仪 电泳仪 凝胶成像系统
白得实验室仪器（苏州）有限公
司
湖南赛特湘仪离心机仪器有限
公司
广州承越生物技术有限公司（广
州鼎国生物）
MJ RESEARCH,INC 北京市六一仪器厂
附录C 实验主要试剂信息表
H1650 DYY-5 TRANSILLUMINATOR BINTA 2020D
主要试剂 亚硫酸铋选择培养基
生化实验试剂盒
沙门氏菌A-F群“O”多价诊断试剂盒 沙门氏菌“Vi”血清诊断试剂盒
DNA marker
生产厂家
广东环凯生物科技有限公司 广东环凯生物科技有限公司 宁波天润生物药业有限公司 宁波天润生物药业有限公司 宝生物工程(大连)有限公司 宝生物工程（大连）有限公司
GENE COMPANY LTD 宝生物工程(大连)有限公司 宝生物工程（大连）有限公司 宝生物工程（大连）有限公司 宝生物工程(大连)有限公司
Loading buffer
琼脂糖 EB染料
TaqDNA 聚合酶
dNTPS 引物
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电子科技大学中山学院毕业设计（论文） 致谢
致谢
本实验是在李雪雁老师指导下完成的，从实验的设计到实验操作以及最终论文的书写上，李老师都给予了悉心地指导与建议，感谢李老师不辞辛苦的指点及这两年来对我的专业课的教导工作。
感谢电子科技大学中山学院以及化学与生物工程学院对我的栽培和教育，并最终顺利完成学业，取得自己满意的成绩。
付涛 于 电子科技大学中山学院
2012年4月30日
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