PFGE标准程序
一、胶块制备
1． 在Falcon2054管标记样品名称和空白对照，分别加入约1ml细胞悬浊液（CSB）。 2． 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称。 3． 在模具上标好对应样品的名称。
4． 用CSB润湿棉签，从培养皿上刮取适量的细菌，均匀悬浊于CSB中，用
BioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5 。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。
5． 取300ul细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分
钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6． 从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20ul蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）
混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。
7． 制备好1% Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。
8． 在eppendorf管中加入300ul的1% Seakem Gold：1%SDS，快速轻轻颠倒混匀。 9． 立即将混合物加入模具（避免气泡产生），在室温下凝固10-15分钟。
注意事项：
（1） 用后的棉签或接种环要放在指定的废弃物容器中。 （2） 细胞悬浊液，蛋白酶K要置于冰上。
（3） 在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。 （4） 混合物加入模具时不能产生气泡。
（5） 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中，1% Seakem Gold：1%SDS要
一直放在56℃水浴箱中。
二、细胞裂解
1． 在50ml screw-cap tube 标记管上做好标记。
2． 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25ul蛋白酶K（20mg/ml），
使其终浓度为0.1 mg/ml，然后颠倒混匀。
注意：蛋白酶K要置于冰上，配置好的CLB也要置于冰上。 3． 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。
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4． 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。 （1）可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。 （2）一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。 5． 保证胶块在液面下而不在管壁上。 6． 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时以上，转速约80转/分钟。 7． 将纯水及TE置50℃水浴摇床中预热。 三、胶块洗涤 1．从水浴摇床中取出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB，在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。 注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体尽量被排除干净。随后的操作也如此。 2．每管中加入15ml预热的纯水。 3．确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4．倒掉水，用纯水再洗一次。 5．倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃水浴摇床中摇15分钟。 6．倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10-15分钟。 7．倒掉TE，加入5-10ml TE，置4℃冰箱保存备用。 注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。 四、胶块内DNA的酶切 1．在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。 2．按照下面的比例配制酶切缓冲液，混匀。 试剂 纯水 Buffer 总体积 ul/胶块 180ul 20ul 200ul ul/10胶块 1800ul 200ul 2000ul 注意：缓冲液要置于冰上。 3． 在每个1.5ml eppendorf管中加入200ul酶切缓冲液。 4． 小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。
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5． 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下，将剩余的胶块放回到原来的TE中。 6． 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。 7． 将eppendorf管放在37℃水浴中平衡10-15分钟。 8． 在用酶切缓冲液平衡的过程中，按照以下的比例配制酶切反应体系，混匀。 试剂 纯水 Buffer 酶 (10u/ul) 总体积 注意： （1） 将酶放置在冰上，用后立即放在-20℃保存。 （2） 用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。 9． 每管加入200ul混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面下。 10．在37℃水浴中孵育4小时。 ul/胶块 175ul 20ul 5ul 200ul ul/10胶块 1750ul 200ul 50ul 2000ul 五、加样 （一）胶块直接粘在梳子齿上 1． 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。 2． 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 3． 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 4． 每管加入200ul 0.5×TBE，平衡5-10分钟。 5． 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上；如果用的是15个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10、15个齿上。 6． 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。 7． 把梳子放入胶槽，确保所有胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢倒入100ml在55℃-60℃平衡的1%SKG胶。避免气泡的生成，如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。 8． 记录加样顺序。 （二）胶块直接加在加样孔内 3
1． 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定的距离。用水平仪调整胶槽使其
水平。
2． 把梳子放入胶槽，从胶槽中央缓慢倒入100ml 在55℃-60℃平衡的1%SKG胶。
避免气泡的生成，如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。 3． 小心拔出梳子。
4． 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 5． 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 6． 每快胶加入200ul 0.5×TBE平衡5-10分钟。 7． 用小铲将胶块加入加样孔。 8． 用熔化的胶封闭加样孔。
注意：
（1） 可以在加样孔中加入0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽
量避免气泡形成。 （2） 记录加样顺序。
六、电泳
1. 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触碰电极。 2. 加入2.2L 0.5×TBE，关上盖子。
3. 打开主机和泵开关，泵设于70（缓冲液流速约1L/分钟）和缓冲液在管道中正常循环。
4. 打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达此温度通常为20分钟左右） 5. 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周及底面多余胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。 6. 设置电泳参数。
7. 记录电泳初始电流（通常120-145ma）。 8. 结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。 注意：
（1）一般配制2500ml的0.5×TBE，100ml用以制胶，50ml用以平衡胶块，余下
的用作电泳缓冲液。
（2）在电泳前要先用2000ml纯水循环2小时，再改用2350ml 0.5×TBE循环2小
时。电泳结束后TBE先不用放掉，等到下一次电泳前再放掉。
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七、 染胶和图像的获取
1．胶取出放在400ml EB溶液的托盘内（400ml H2O+40ul 10mg/ml EB）染胶25-30分钟。
2．500ml纯水摇床脱色4-5小时。
3．Gel Doc 1000、Gel Doc 2000拍摄力图像，储存为*.img或*.lsc文件，转换为*.tif格式用BioNumerics软件进行分析。
4．放掉电泳槽中的TBE，用2L纯水清洗电泳槽，开泵循环5-10分钟，放掉液体。 5．如有的菌株跑不出来，在2L加入10mg/ml硫脲760ul。
注：如在24-28h 内没获得PFGE结果，可采取下面措施：
1．胶块可裂解更长时间（3-16h）。
2．TE洗涤时间可以更长（30-45分钟），温度更低（37℃或室温）。 3．内切酶消化时间更长（3-16h）。
4．如果H9812最小的一条带距胶的边缘不在1.1-1.5cm范围，则需要调整电泳时间。 5．降低菌液的浓度。
试剂储存液的配制
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1、1M Tris-HCl，pH8.0
121.1g Tris base溶于650-700ml的纯水中，加入80ml 6N HCl，在室温下调pH至8.0，
加水终体积至1000ml，高压灭菌。
或者157.6g Tris-HCl溶于800ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至
1000ml，高压灭菌。 2、10N NaOH
400g NaOH小心溶于800ml纯水中，冷却至室温，加灭菌的纯水使终体积至1000ml。
3、0.5M EDTA，pH8.0
186.1g Na2EDTA-2HO2溶于800ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水
终体积至1000ml，分成数份，高压灭菌。
4、20% Sodium Dodecyl Sulfate（SDS）－十二烷基磺酸钠：用于E.coli O157:H7，Salmonella 和 Shigella sonnei，PFGE
将20克SDS小心加入装有80ml灭菌纯水的容器中，在35-45℃轻轻混匀溶解，定
容至100ml。
5、10% Sarcosyl－十二烷基肌氨酸钠
10g Sarcosyl溶于80ml的纯水中，水浴40-50℃助溶，定容至100ml，不用高压。
6、20mg/ml蛋白酶K储存液
100mg Proteinase K粉末溶于5ml灭菌纯水中，混匀，分装在1.5ml离心管中，每
管500-600 ul，-20℃保存备用。
7、10×Tris-Borate EDTA Buffer（TBE），pH8.3
0.9M Tris base（108g） 0.9M Boric Acid（55g）
0.02M EDTA，pH8.0（40ml，0.5M） 溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌 或者5×TBE：
0.9M Tris base（54g）
0.9M Boric Acid（27.5g）
0.02M EDTA，pH8.0（20ml，0.5M）
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溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌
注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。 8、Ethidium Bromide（EB）
10mg/ml EB的储存液用纯水1：10000稀释（即100ml水中加入10ul储存液），（500ml
水中加入50ul储存液）.稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。
实验试剂
注意：用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。
1、Tris:EDTA Buffer（TE），pH8.0－（10mM Tris-HCl:1mM EDTA，pH8.0）
10ml 1M Tris-HCl，pH8.0 2ml 0.5M EDTA,pH8.0 用灭菌的纯水稀释到1000ml
在E.coli O157:H7，Salmonella 和 Shigella sonnei，Campylobacter jejuni PFGE－用TE Buffer于:
（1） 溶解1% Seakem Gold：1%SDS agarose （2） 细菌裂解后洗胶块
在L.monocytogenes PFGE－用TE Buffer于：
（1） 悬浮菌细胞 （2） 细菌裂解后洗胶块
2、Cell Suspension Buffer（CSB）－100mM Tris-HCl:100mM EDTA，pH8.0 用于E.coli O157:H7，Salmonella 和 Shigella sonnei PFGE
10ml 1M Tris-HCl，pH8.0 20ml 0.5M EDTA，pH8.0
用灭菌纯水稀释到100ml。
3、Cell Lysis Buffer（CLB）－50mM Tris-HCl:50mM EDTA，pH8.0＋1% N-Lauroyl-Sarcosine，Sodium salt（Sarcosyl）,0.1mg/ml Proteinase K （用前再加入）
用于裂解E.coli O157:H7，Salmonella ， Shigella sonnei和Campylobacter jejuni
25ml 1M Tris-HCl，pH8.0
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50ml 0.5M EDTA，pH8.0 50ml 10% Sarcosyl
用灭菌的纯水稀释到500ml，每5ml CLB加入25ul蛋白酶K储存液（20mg/ml），使其终浓度为0.1 mg/ml。 4、0.5×TBE Buffer 200ml 5×TBE用纯水稀释到2000ml或
100ml 10×TBE用纯水稀释到2000ml
注意：用来稀释5×TBE、10×TBE的纯水可以不灭菌。 5、1% Seakem Gold：1%SDS 10ml 低熔点琼脂糖 100mg TE 9ml 10%SDS 1ml
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